Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Сохранение в герметично закрытой камере небольшого объема воздуха предотвращает потерю из среды двуокиси углерода. Количество же кислорода, присутствующего в пузырьке воздуха и растворенного в среде, удовлетворяет потребности клеток, если их не слишком много и если среда меняется не реже одного раза в 3 дня.
Макрофаги, культивируемые в таких камерах, сохраняют сферическую форму и не прикрепляются к дну в течение 12 ч после посева, тогда как в камерах со стеклянным дном при прочих равных условиях они прикрепляются к дну через 2—3 ч. Однако после этого первоначального лаг-периода клетки введут себя, как обычно, и если среду меняют каждые 3 дня, то они сохраняют жизнеспособность в течение 10 дней; при микроскопическом исследовании в них не удается выявить каких бы то ни было нарушений. Задержка в прикреплении клеток к дну камеры, вероятно, связана с тем, что поверхность пластика, из которого изготовлены камеры, не смачивается водой.
Камера Уосли особенно ценна для тех случаев, когда в исходном материале мало клеток (как это часто бывает при работе с макрофагами), поскольку небольшая площадь дна камеры (7,5 мм2) и сравнительно большой объем суспензионной среды дают возможность создать
высокую концентрацию «клеток на единицу площади. Кроме того, такие камеры позволяют получить сразу много идентичных культур и одновременно исследовать влияние на них различных агентов в разных концентрациях.
СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МАКРОФАГОВ
Проблема питательных сред подробно рассмотрена в гл. 1. Однако краткое повторение основных принципов здесь не помешает, поскольку среда представляет собой наиболее важный фактор при культивировании клеток и тканей.
Среда выполняет следующие функции: создает для клеток и поддерживает определенную концентрацию водородных ионов и осмотическое давление, сохраняя клетки от разрушения; обеспечивает клетку различными минеральными солями, аминокислотами, углеводами и витаминами, которые клетки не способны синтезировать сами, но которые необходимы для их длительного выживания; она доставляет клеткам кислород и двуокись углерода.
Естественные и синтетические среды определенного состава
Очевидно, что исследования биохимических и других аспектов жизнедеятельности клетки значительно упростились бы, если бы можно было культивировать клетки на среде строго определенного состава, представляющей собой смесь чистых химических веществ. Такие среды существуют и успешно применяются для культивирования растительных клеток. Однако для роста животных клеток (за исключением одной-двух особых линий клеток, культивируемых на протяжении многих генераций) до сих пор подобных сред не создано. Для культивирования животных клеток нужна либо целиком естественная среда, например плазма, либо синтетическая среда с добавками некоторых естественных компонентов, таких, как сыворотка. Для получения однослойной культуры клеток пригодна только среда с добавка-
ми, поскольку она жидкая; плазма же без обработки высокими дозами антикоагулянтов (что нежелательно) быстро свертывается при соприкосновении со смачиваемой поверхностью сосуда, что мешает нормальному оседанию клеток на поверхности.
Обеспечение кислородом и двуокисью углерода
Большинство нормальных клеток, в том числе макрофаги, нуждается в кислороде. Даже те клетки, которые способны удовлетворять свои энергетические потребности без кислорода (за счет гликолиза), для синтеза различных клеточных компонентов нуждаются в некоторых продуктах цикла Кребса. Большинство клеток в культуре, как и в организме интактного животного, используют для метаболизма углеводов как дыхание, так и гликолиз.
При культивировании клеток в пробирках кислород поступает к ним путем диффузии через среду из воздушного пространства пробирки. В камерах Тревана—Робертса, Приора и Круикшенка—Стерилина объем окружающего газового пространства значительно больше объема среды, и содержание кислорода в таких камерах достаточно для поддержания жизнеспособности клеток в период (между сменами среды. В камере Уосли каждая лунка содержит мало клеток, поэтому, как уже отмечалось, в период между сменами среды им хватает растворенного кислорода и кислорода, присутствующего в пузырьке воздуха.
Для оптимального роста и функционирования клеткам разного типа требуются различные количества кислорода. К удобству экспериментаторов при культивировании постэмбриональных макрофагов млекопитающих оптимальная концентрация кислорода в газовой фазе, по-видимому, соответствует его содержанию в атмосферном воздухе.
Присутствие двуокиси углерода в среде для некоторых клеток необходимо и для всех — желательно. Двуокись углерода, выделяемая в процессе дыхания клеток, растворяется в среде с образованием ионов бикарбоната. Эти ионы оказывают сильное буферное действие не
только в среде, но, вероятно, и в клетке. Кроме того, имеются данные об участии двуокиси углерода в цикле Кребса.
Если клетки культивируют в сосудах со свободным газовым пространством, то часть двуокиси углерода уходит в это пространство. Естественно, что чем больше объем газового пространства по отношению к объему среды и числу клеток в культуре, тем больше будут эти 'потери. Их можно уменьшить, сведя к минимуму объем газового пространства и герметично закрыв камеру,— именно это обеспечивает камера Уосли. Другой способ— поддерживать в атмосфере над средой, в которой культивируются клетки, 5%-ную концентрацию двуокиси углерода. Этого можно достичь очень простым способом— вдувая в камеру время от времени через фильтр 'выдыхаемый воздух или, что более изысканно, пропуская через газовое пространство постоянную струю газа определенного состава (как это делают при работе с камерами типа Тревана—Робертса и Приора).
