Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Кроме улучшения оптических качеств, в конструкцию некоторых камер были внесены и другие усовершенствования, благодаря чему время поддержания культур в камерах удалось довести до 2—3 нед. В усовершенствованных вариантах имеется дополнительное пространство, окружающее растущие клетки, которое обеспечивает газообмен. Это «газовое пространство», как его называют, сообщается через специальные канальцы с внешней средой, чго позволяет регулировать состав атмосферы в камере без риска инфицировать культуру. Через те же или дополнительные канальцы в камеру можно вводить иглы, с помощью которых осуществляют посев клеток и смену среды. В наиболее усовершенствованных камерах возможен постоянный контроль за составом среды и атмосферы. Доступ в «газовое пространство» и к клеткам в таких камерах, а также их высокие оптические качества, позволяющие проводить длительные микроскопические наблюдения над живыми клетками, дают возможность исследовать влияние на клетки разнообразных веществ, жидких и газообразных, в растворе или в суспензии. Две такие камеры (исходная модель и фирменная модификация) будут описаны ниже.
Камера Тревана и Робертса и камера Приора. Камера Тревана и Робертса1 [29], хотя и имеет довольно сложную конструкцию и требует применения длиннофокусного конденсора (нижняя стенка камеры находится
1 Эта камера в несколько модифицированной форме под названием Prior Tissue Culture Chamber выпускается фирмой W. R. Prior and Co. Ltd., London Road, Bishop’s Stortford, Hertfordshire.
на расстоянии 4,4 мм1 от нижней поверхности пластины), проста в обращении и дает возможность проводить самые разнообразные исследования. Первоначально ка-
Рис. 5.4. Рисунок камеры Тревана и Робертса с газовыми иглами
и фильтрами.
мера была задумана для работы с инвертированным микроскопом, но она вполне пригодна и при работе с обычным микроскопом. Однако в этом случае в пер-
1 В модификации Приора — 4,9 мм.
вые несколько часов инкубации камеру следует держать перевернутой. При возвращении камеры в исходное положение клетки, прикрепившиеся к верхней стенке, можно наблюдать в обычный микроскоп.
Камера предназначена для многократного использования; ее можно полностью разобрать и тщательно вымыть. Она состоит из двух круглых покровных стекол диаметром 32 мм, образующих верхнюю и нижнюю стенки, отделенные друг от друга расстоянием 2 мм (около 1,9 мм в первоначальном варианте и около 2,2 мм в камере Приора) с помощью круглого кольца из силиконовой резины. Покровные стекла и резиновое кольцо находятся между двумя кольцевыми пластинками из алюминиевого сплава с наружным диаметром примерно 40 мм. Верхняя и нижняя пластинки скрепляются тонкими шурупами (рис. 5.4). Перед работой на периферическую часть внутренней поверхности каждого покровного стекла наносят силиконовую смазку, оставляя в центре чистый кружок диаметром около 10 мм. При посеве среда и клетки занимают только этот центральный кружок, а свободная периферическая часть служит газовым пространством.
Нижняя металлическая пластинка снабжена двумя радиально расположенными суживающимися к концу трубочками из нержавеющей стали, на концы которых надеваются плотно пригнанные колпачки с накаткой из алюминиевого сплава. В исходной модели эти трубочки расположены под углом 60°, а в модификации Приора (рис. 5.5) — напротив друг друга (что создает определенные трудности при работе, о которых будет сказано ниже). Желательно как при снятии, так и при надевании вращать их только по часовой стрелке, чтобы не ослабить трубочки! Каждый колпачок (в модификации Приора) имеет на наружном конце две параллельные площадки, чтобы его удобно было захватить пинцетом. Диаметр просвета трубочки чуть меньше глубины камеры. Каждая трубочка расположена таким образом, что ее внутреннее отверстие, диаметр которого почти полностью совпадает с промежутком между покровными стеклами, упирается в резиновое кольцо. Для посева клеток и смены среды используют иглу длиной 38 мм и диа-
метром 0,55 мм; ее проводят через одну из трубочек (назовем их направляющими) к резиновому кольцу и про-кальгвают резиновое кольцо. Благодаря эластичности резины место прокола по извлечении иглы полностью закрывается. При необходимости эту операцию можно производить многократно. Для постоянной перфузии культуры используют обе трубочки.
Рис. 5.5. Вид камеры Приора, вмонтированной в основную пластину.
В камеру вставлены газовые иглы, которые должны иметь металлические наконечники, чтобы выдержать стерилизацию сухим жаром.
В нижней пластинке, кроме того, имеется два радиально расположенных отверстия, которые лежат в той же плоскости, что и направляющие трубочки. В исходной модели они расположены симметрично по отношению к последним и под углом 100° друг к другу (рис. 5.4), в камере Приора они также лежат симметрично по отношению к направляющим трубочкам, но между ними и под углом 115° друг к другу (рис. 5.5). Через эти отверстия проводят иглы (длиной 13 мм и диаметром 0,55 мм) в периферическую часть камеры — в газовое пространство. Эти иглы, которые находятся в камере постоянно в течение всего периода культивирования, снабжены ватным фильтром от пыли и служат для поддержания постоянного давления в камере, что особенно важно при введении и удалении жидкости из центральной части камеры. С их помощью можно поддерживать физиологический оптимум состава атмосферы
