Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Хорошим источником макрофагов может служить жидкость, взятая из брюшной полости у больных при перитонеальном диализе по поводу хронической почечной недостаточности. Такая жидкость содержит много макрофагов и обычно свободна от других клеток.
Само собой разумеется, что использование этого источника макрофагов ограничено, так как он доступен лишь лабораториям, расположенным вблизи клинических центров, где проводится терапия диализом. Правда, это ограничение постепенно отпадает, поскольку таких центров становится все больше — в настоящее время они созданы в большинстве учебных клиник и при многих крупных больницах. Стало быть, вполне возможно, что применение указанного источника макрофагов будет расширяться, и потому вовсе не лишними будут здесь некоторые предостерегающие замечания относительно опасностей, связанных с его применением. В случаях хронической почечной недостаточности иммунные механизмы подавлены, и полагают, что такие больные часто бывают постоянными носителями возбудителя сывороточного гепатита даже в отсутствие явных клинических симптомов этой болезни. Этот возбудитель находится в крови и загрязняет аппаратуру, используемую для диализа, а так как он отличается высокой инфек-ционностью и обычно термостабилен, то опасен не только для других больных, но и для всех, кто работает с кровью и с перитонеальным диализатом и кто обслуживает аппаратуру. Так как сывороточный гепатит нередко протекает очень тяжело и иногда приводит к летальному исходу в остром периоде или переходит в хроническую форму, вызывая тяжелое поражение печени, при работе с перитонеальным диализатом следует соблюдать сугубую осторожность (соответствующие меры описаны ниже).
Много свободных макрофагов присутствует в легких (альвеолярные макрофаги). Мирвик и др. [28] предложили сравнительно простой метод их получения путем смывов из альвеол и воздухоносных путей кролика. Мы не применяли этот метод сами, но у нас создалось впечатление, что, хотя он не лишен ряда недостатков, на которые мы укажем позже, этот метод позволяет получить вполне пригодный материал с высоким выходом макрофагов; посторонних клеток в нем мало, и, кроме того, они представлены главным образом нейтрофиль-ными полиморфноядерными лейкоцитами, от которых легко 'избавиться.
Получение макрофагов из трех упомянутых выше источников, а именно из брюшной полости мыши и человека и из легких кролика, а также методика культивирования этих клеток подробно описаны в соответствующих разделах.
АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ
ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Все, с чем непосредственно или косвенно соприкасаются клетки или среда, должно отвечать строгим требованиям чистоты и стерильности, обязательным при работе с культурой ткани.
Стеклянную посуду моют детергентами, например пиронегом (Pyroneg), а затем тщательно несколько раз промывают бидистиллированной (в стеклянном дистилляторе) или деионизованной водой. Подложки из белка и других веществ, на которых выращивают клетки, удаляют со стенок сосудов ершиком. Выполнять это следует очень тщательно, так как клетки имеют тенденцию мигрировать вдоль полосок субстрата, оставляемых ершиком, в результате чего создается ошибочное представление о каком-то особом типе распределения клеток (рис. 5.1). Не следует использовать для мытья посуды такие вещества, как, скажем, хромовую кислоту, поскольку ее трудно удалить полностью. Желательно, чтобы вся стеклянная посуда, которую приходится часто мыть, была изготовлена из боросиликатного стекла, которое не подвергается коррозии под влиянием фосфатов, присутствующих во многих детергентах.
Неравномерное распределение клеток по стенке сосуда может быть также следствием царапин на стекле (рис. 5.2) или зазубрин на пластике, поэтому поверхность, на которой будут расти клетки, следует тщательно осмотреть. Для пробок и прокладок лучше всего использовать силиконовую резину. Пригодна также нетоксичная белая резина, которая дешевле силиконовой, однако она быстрее разрушается при стерилизации нагреванием.
Стеклянную посуду предпочтительнее стерилизовать не в автоклавах, а в сушильных шкафах (сухим жаром)
Рис. 5.1. Влияние на распределение клеток посторонних веществ, оставшихся после мойки на стенке сосуда; об. 10 X, ок. 8 X.
Микрофотография живых клеток культуры перитонеальных макрофагов мыши
на стенке пробирки.
Рис. 5.2. Влияние на распределение клеток царапин, оказавшихся на поверхности покровного стекла камеры Стерилина; об. 10Х;
ок. 8 X.
Микрофотография живых перитонеальных макрофагов мыши; покровное стекло не было тщательно осмотрено перед употоеблением. Обратите внимание, что ка*
чество изображения лучше, чем на рис. 5.1.
при 180 °С в течение полутора часов. Дело в том, что вода в автоклавах нередко содержит примеси, которые осаждаются на стенках стерилизуемых сосудов; это опять-таки создает субстрат, ведущий к артефакту распределения.
Силиконовая резина выдерживает повторную стерилизацию сухим жаром и при этом сохраняется значительно дольше, чем белая. Последнюю лучше стерилизовать другим способом, а именно автоклавированием (10 мин). При таких условиях она дольше сохраняется.
