Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Когда макрофаги прикрепятся к дну, исходную среду заменяют свежей, предварительно нагретой до 37°С;
Рис. 5.9, Брюшко мыши, растянутое инъецированной средой я воздухом.
Пурод отсади вешнем ryt-'iieinnH иглой оттягивают боковую стенку живота.
при этом другие клетки удаляются из культуры, после чего камеры можно переворачивать для микроскопического исследования.
ПЕРИТОНЕАЛЬНЫИ ДИАЛИЗАТ, ВЗЯТЫЙ У ЧЕЛОВЕКА
Перитонеальный диализат является очень хорошим источником человеческих макрофагов; в нем их, как правило, много; других же клеток — эритроцитов, тучных клеток и слушавшихся клеток брюшины — мало.
Однако при всех своих достоинствах этот источник макрофагов имеет весьма серьезный недостаток, о котором говорилось выше: диализат бывает заражен возбудителем сывороточного гепатита. Насколько нам известно, этот вирус не оказывает повреждающего воздействия на макрофаги, однако вероятность его присутствия в диализатах обязывает лиц, работающих с ними, строго соблюдать все меры предосторожности против случайного заражения. Возбудитель может попасть в организм через мельчайшие царапины на коже, поэтому работать с диализатами необходимо в резиновых перчатках. Имеются данные о возможности заражения через пищеварительный тракт, поэтому при работе следует надевать плотно пригнанную маску. Это особенно важно во время мытья посуды, поскольку в брызгах, в мельчайших капельках влаги, которыми насыщен окружающий воздух, может присутствовать вирус. Кроме того, перед мытьем посуду следует замачивать на 1,5 ч в растворе детергента.
Собирать диализат должен обязательно кто-либо из персонала клиники. Для этого удобны плоскодонные флаконы на 500 мл с завинчивающимися крышками и резиновыми прокладками. Стерилизуют их сухим жаром и хранят в холодильнике там же, где берут пробы. Диализат собирают в охлажденные флаконы (естественно при строгом соблюдении асептики); быстрое охлаждение снижает потерю макрофагов, уменьшая их способность прикрепляться к стенкам флакона. От одного больного обычно получают 0,5—2 л диализата. Как правило, лечение диализом проводится курсами, и обычно наибольший выход клеток содержится во второй порции диализата. Флаконы с диализатом сразу же доставляют в лабораторию в термосе со льдом или в сумке-холодильнике. Конечно, желательно оповестить об этом заранее, чтобы в лаборатории все было готово.
В лаборатории диализат сначала исследуют невооруженным глазом. Он должен быть соломенного цвета, прозрачным. Если проба слегка мутная, с ней работать можно, если же в ней заметна примесь крови, то от ее использования приходится отказаться. Дальнейшая работа с диализатом состоит из следующих этапов (объ-
емы приведены в расчете на 1 л диализата со средним содержанием макрофагов; при использовании других количеств диализата объемы соответственно изменяют):
1. Диализат центрифугируют (15 мин при 800 об/мин) при температуре не выше + 10°С. Для этой цели желательно иметь центрифугу с охлаждением, но если пробирки и стаканы предварительно охладить, можно работать и на обычной центрифуге,
2. Надосадочную жидкость выливают, а осадок переносят в чистые центрифужные пробирки, содержащие 100 мл раствора Хэнкса с бикарбонатом.
3. Полученную суспензию центрифугируют (см. п. 1), надосадочную жидкость выливают, а осадок суспендируют в 10 мл культуральной среды, содержащей сыворотку человека (в большинстве случаев пригодна сыворотка, полученная из донорской крови любой группы).
4. Подсчитывают клетки. Рабочая концентрация суспензии должна быть 300 000—500 000 ядросодержащих клеток в 1 мл. Если концентрация в суспензии выше, ее разбавляют, если ниже, ее центрифугируют и осадок клеток суспендируют в меньшем объеме среды.
5. Суспензию клеток переносят в сосуды для культивирования (количество суспензии для разных типов сосудов было указано выше) и инкубируют при температуре 37 °С.
6. После того как клетки прикрепятся к стенке сосуда (2—3 ч, если поверхность стеклянная или из смачиваемого пластика, и 10 ч, если поверхность несмачи-ваемая), среду заменяют свежей теплой средой. При смене среды из культуры удаляется большинство посторонних клеток.
МАТЕРИАЛ ИЗ ЛЕГКОГО КРОЛИКА
У нас нет собственного опыта по использованию этого источника макрофагов, однако, по-видимому, он имеет три весьма существенных достоинства. Во-первых, этот метод получения макрофагов (альвеолярных фагоцитов), предложенный Мирвиком и др. [28], очень прост — клетки вымываются из легких кролика физиологическим раствором через трахею. Во-вторых, он обес-
печивает высокий выход макрофагов — в среднем около 12000000 клеток из легких одного животного. В-третьих, из других клеток вместе с макрофагами вымываются только полиморфноядерные лейкоциты, причем их примерно в 100 раз меньше, чем макрофагов, и они погибают в культуре через 1—2 дня; очень редко встречаются лимфоциты, которые тоже, как правило, быстро погибают. Этим достоинствам противостоят три недостатка, из которых два несущественны, а третий делает такие макрофаги не пригодными для некоторых целей. Во-первых, даже у здоровых животных в трахее и крупных бронхах, как правило, присутствуют бактерии, поэтому в культуральную среду всегда приходится добавлять антибиотики. Во-вторых, поскольку сыворотка некоторых кроликов токсична для клеток других животных, в том числе и кроличьих, то лучше в качестве естественного компонента среды использовать не гомологичную, а аутологичную сыворотку, что несколько усложняет методику. Наконец, в-третьих, альвеолярные фагоциты, по крайней мере кроличьи, содержат значительные количества лизоцима, которого нет в перитонеальных макрофагах и, возможно, в макрофагах, полученных из других источников. Эту особенность нужно по крайней мере иметь в виду при экспериментальном исследовании действия таких альвеолярных макрофагов на бактерии.
