Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фридлянской И.И. -> "Новые методы культуры животных тканей" -> 56

Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.

Фридлянской И.И., Олева Ю.В. Новые методы культуры животных тканей — М.: Мир, 1976. — 255 c.
Скачать (прямая ссылка): noviemetodikulturi1976.djvu
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 80 >> Следующая

Суспензии от разных мышей собирают в один стерильный флакон. Флакон нужно держать на холоду, чтобы макрофаги не прикреплялись к стеклу; среду перед инъекцией тоже лучше охладить. Для этого сосуды с клетками и средой держат в чашке с кубиками тающего льда. Работать нужно быстро, так как чем больше времени пройдет после смерти животного, тем меньше будет выход макрофагов. Если требуется много суспензии и приходится забивать по многу мышей, следует это делать не сразу, а партиями по 3—4 животных.
Присутствие воздуха в инъекционной среде (оптимально 1,5 мл) способствует эффективности массажа и, следовательно, высвобождению макрофагов. Кроме того, он увеличивает объем брюшной полости и смещает кишечник, что облегчает отсасывание суспензии.
Метод
1. Подготовка животного. Забитую мышь укладывают на спину, вытянутые конечности фиксируют булавками, живот и боковые поверхности туловища протирают
70%-ным спиртом. Лучше, если все это выполняет помощник. Тем временем экспериментатор тщательно моет руки в проточной воде, лучше асептическим мылом (с гексахлораном), споласкивает их и вытирает стерильным полотенцем.
Животное располагают головой от экспериментатора. Пинцетом с зубчиками захватывают кожу по средней линии живота над лобком, оттягивают ее и образовавшуюся складку разрезают поперек ножницами. Передний край короткого поперечного разреза кожи оттягивают вверх от подлежащей фасции, подводят под кожу ножницы и делают разрез по средней линии брюшка вдоль груди и шеи почти до рта. При разрезании нижнюю браншу ножниц приподнимают, чтобы не повредить подлежащие ткани. Для этой цели удобны ножницы Мэйо с узкими тупыми концами. Большим и указательным пальцами руки захватывают края продольного разреза чуть дальше средней линии и одновременно растягивают их в стороны и чуть вверх, чтобы отделить кожу от подлежащей фасции; при этом обнажаются боковые стенки живота и обе паховые области; лоскуты кожи фиксируют булавками с небольшим натяжением. Таким образом, глубокая фасция боковой и передней брюшной стенок, кроме области средней линии, открывается асептически.
2. Инъекция среды и воздуха. Инъекцию делают через брюшные мышцы в точке несколько выше левой паховой области и левее средней линии. Используют 5-миллилитровый шприц с иглой длиной 16 мм и диаметром 0,45 мм. В шприц набирают 1,5 мл стерильного воздуха из стерилизатора и 3,5 мл охлажденной среды.
Шприц держат так, что игла сначала находится параллельно средней линии тела животного и поверхности доски, на которой оно фиксировано; затем кончик иглы вводят в наружный слой мышц, так чтобы скос иглы был обращен вверх. Не изменяя направления кончика иглы, шприц с иглой поворачивают на 180°, иглу проводят сквозь остальные слои и одновременно слегка нажимают на поршень шприца. Из-за естественной выпуклости брюшка при косом прохождении иглы скос ее практически параллелен пристеночной брюшине. Про-
калывают пристеночную брюшину; этот момент легко распознать, поскольку через тонкую и почти прозрачную мускулатуру хорошо видно, как при вливании жидкости перемещаются близлежащие петли кишечника. Затем медленно вводят все содержимое шприца, двигая иглу вперед примерно на миллиметр. При инъекции брюшко животного постепенно растягивается и становится заметно выпуклым. По извлечении иглы мышцы брюшной стенки сокращаются и закрывают прокол.
3. Массаж. Массаж состоит в легком и быстром постукивании по самой выпуклой части брюшной стенки кончиком указательного или среднего пальца правой руки. Массаж делают не менее 1 мин,
4. Отсасывание суспензии. Пользуются 5-миллилит-ровым стерильным шприцем с иглой длиной 38 мм и диаметром 0,8 мм. Иглу вводят в точку, находящуюся несколько сзади от наиболее выпуклой части правой половины брюшка. Кончиком иглы прокалывают мышцу и шприц с иглой поворачивают точно так же, как при инъекции среды. Прежде чем ввести иглу в брюшную полость, ею оттягивают боковую стенку живота, чтобы образовался перитонеальный карман, в котором накапливается суспензия (рис. 5.9). В этот карман вводят иглу, отсасывают суспензию (обычно это удается легко) и переносят ее в охлажденный сосуд.
5. Подсчет клеток. Пользуются обычной камерой для счета клеток крови. Камеру заполняют каплей неразбавленной и неокрашенной суспензии и считают все видимые клетки. Обычно получают концентрацию порядка 1 ООО ООО клеток в 1 мл. Одну треть этих клеток составляют макрофаги, остальные представлены предшественниками макрофагов, лимфоцитами, эозинофила-ми и тучными клетками. В том случае, если концентрация оказывается выше, суспензию разводят холодной средой.
6. Посев. Посевная доза зависит от типа выбранного сосуда (см. выше). Сосуды с суспензией ставят в термостат (37 °С). Через несколько часов большинство клеток оседает на дно сосуда, и если дно сделано из стекла или смачиваемого водой пластика, то макрофаги (и только макрофаги) прикрепляются к нему. Если же
дно сосуда сделано из несмачиваемого материала (камера Круикшенка, Купера и Конрана, микрокамеры Уосли), то макрофаги прикрепляются лишь спустя 10 ч.
Предыдущая << 1 .. 50 51 52 53 54 55 < 56 > 57 58 59 60 61 62 .. 80 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed