Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
6-2. При эффективности 94% можно будет обнаружить только 0,94-42 = = 39 лучен. Вследствие логарифмической зависимости распада уравнение, описывающее время t, необходимое для получения N лучей при 7V0 —39 обнаруживаемых атомов 32Р, выглядит так:
ГЛАВА
oQ -0,6937/14 2 —0,049/
39е — 39?
Следовательно, для N= 12 / = 7,5 дня.
6-3. Если используется соединение, меченное 3Н, и авторадиограмма получается либо методом покрывающей пленки, либо методом погружения, плотность зерен будет максимальной вблизи от наблюдаемой границы клетки, однако она будет размыта по внутренней площади клетки, так как при наблюдении клеточная стенка находится и над, и под клеткой. Если же вещество находится только в цитоплазме, то плотность зерен будет либо равномерной по площади клетки, либо максимальной в тех участках, где клетка более толстая. Если авторадиограмма получается для тонкого среза клетки, то все зерна будут находиться на границе в том случае, когда вещество локализовано в клеточной стенке.
6-4. Клетки выращивают в стационарной фазе (т. е. деления клеток не происходит) в течение долгого времени в присутствии 3Н-тимидина. Затем клетки переносят на поверхность агара таким образом, чтобы они были отделены друг от друга. После этого клетки оставляют расти без 3Н-тимидина до тех пор, пока они не образуют микроколонию из нескольких сот клеток, после чего поверхность покрывают пленкой. Из-за полуконсервативного характера репликации ДНК одной хромосоме будет соответствовать образование двух меченых клеток в микроколонии. Если клетка содержит 4 хромосомы, то в микроколонин будет содержаться 8 меченых клеток.
6-5. Короткий пробег, свойственный 3Н, будет понижать эффективность, поэтому предпочтение следует отдать 14С. Пробег р-частиц 14С не так велик, чтобы уменьшить разрешение, поскольку длина трека 14С очень мала по сравнению с размерами пятен на хроматограмме,
6-6. Используются 3Н-меченые аминокислоты с применением техники покрывающей пленки или погружения. Вначале клетки выращивают при 37°С в нерадпоактивной среде. Затем добавляют меченую аминокислоту и культуру разделяют на две части, одну из которых выращивают при 37 С, а другую — при 42°С. Через некоторое время клетки авторадиографируют. Если скорость при 42°С отражает тот факт, что включение происходит только в 10% клеток, а в 90% не происходит, то зерна должны иметься только над 10% клеток. Если скорость на клетку понижается в 10 раз, все клетки будут включать метку, однако среднее число зерен на клетку при 42°С составит 10% от того, что получается при 37°С. Для подсчета зерен необходимо использовать различные экспозиции, чтобы получить достаточно малое число зерен, позволяющее провести точный их подсчет.
6-7. Если клетки предварительно пометить путем выращивания в среде, содержащей 3Н-тимидин, а затем авторадиографировать, зерна образуются над всеми клетками. Если маленькие клетки не содержат ДНК, то над ними не будет зерен. Уменьшенное число зерен указывает на пониженное содержание ДНК.
РНК можно исследовать путем выращивания в среде с 3Н-уридином и большим количеством нерадиоактивного тимидина. Уридин является предшественником как РНК, так и ДНК. Тимидин предупреждает появление 3Н в ДНК, конкурируя с тимидином, который синтезируется по схеме уридин — дезоксиуридилат — тимидилат.
6-8. Сделать это не удается, так как при выращивании в присутствии 3Н-тимидина получается слишком много зерен за счет хромосомной ДНК, в которую погружены нуклеоли.
6-9. Мужские и женские клетки обычно не удается различить с помощью оптического микроскопа. Однако, если один тип растет в среде, содержащей 3Н-тимидин, а другой — в присутствии нерадиоактивного тимидина, их можно различить с использованием авторадиографии. Если смешать 3Н-мужские клетки с [Н-женскими, то будут наблюдаться пары, состоящие из одной меченой п одной немеченой клетки. Если культуру 3Н-мужских клеток смешать с другой культурой нерадпоактивных мужских клеток и если при этом произойдет однополовое спаривание, то пары будут содержать одну меченую и одну нерадиоактивную клетки.
ГЛАВА 7
7-1. Нитроцеллюлоза растворима в ацетоне, поэтому лучше использовать стекловолокно.
7-2. Фильтрование следует предпочесть в том случае, когда частицы седиментируют очень медленно и когда осадок трудно вновь суспендировать. Метод не рекомендуется использовать, если количество осадка настолько велико, что фильтр засоряется, или если осадок связывается с материалом фильтра.
7-3. Изучением зависимости удерживания от размера пор. Если происходит адсорбция, то удерживание обычно не зависит от размера пор.
7-4. При высокой скорости потока линейные молекулы ориентируются и проходят сквозь поры по своей длине, тогда как кольцевые молекулы не могут стать достаточно тонкими и задерживаются. При низкой скорости потока задерживаются молекулы обоих типов.
7-5. Следует стерилизовать фильтр, держатель фильтра и сосуд, в который собирается фильтрат.
7-6. Образец отделяют на фильтре из стекловолокна и инкубируют в щелочи. Затем фильтр удаляют и жидкость подкисляют. Образующийся осадок собирают на отдельном фильтре. Значение фона составляет 0,0001*0,01%^ = 0,000001 %. Нитроцеллюлозные фильтры растворяются в щелочи, поэтому их нельзя использовать.
