Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
методике, разработанной для наружной оболочки хлоропластов [174]. После
удаления наружной оболочки этиопластов можно провести фракционирование
внутренних мембран, проламеллярных тел и протилакоидов после
гомогенизации с помощью либо стеклянного гомогенизатора [175, 176], либо
обработки ультразвуком [173, 177]. Проламеллярные тела можно отделить от
фракции протилакоидов центрифугированием в непрерывном или ступенчатом
градиенте плотности сахарозы. При обработке ультразвуком происходит
резкое обеднение фракции проламеллярных тел [177], причем фрагменты этих
органелл загрязняют протилакоидную фракцию. Степень загрязнения
возрастает с увеличением интенсивности воздействия [173].
11.5. Амилопласты
Амилопласты обнаруживаются в незеленых тканях растений и содержат от
одной до нескольких крахмальных гранул на пластиду. Фракция амилопластов
выделена из разных источников - из клубней картофеля [37], суспензионной
культуры клеток сои [178]' и платана [179], эндосперма кукурузы [180] и
корней гороха [181]. Для выделения амилопластов ткань разрушают либо
механически [37, 181], либо с помощью ферментов [178-180], затем
амилопласты собирают осаждением [37, 180] или низкоскоростным
центрифугированием [178, 179, 181]. Фракция ами-
7-1488
98
Глава 2
лопластов, полученная при центрифугировании, может содержать крахмальные
гранулы без мембранной оболочки. Пластиды с многочисленными крахмальными
гранулами (например, амилопласты из корней гороха), как правило, более
стабильны при центрифугировании, чем амилопласты с единственным
крахмальным зерном [180].
Амилопласты выделяют из корней выращенных в темноте растений гороха
согласно следующей методике [181].
1. Измельчают примерно 20 г корней лезвием бритвы в одном объеме среды,
содержащей 50 мМ трицин-NaOH, pH 7,9, 330 мМ сорбитол, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ
MgCb, 0,1%-ный БСА, затем без усилий растирают пестиком в ступке.
2. Фильтруют гомогенат через шесть слоев муслина и центрифугируют в
течение 1 мин при 200 g, чтобы освободиться от интактных клеток, ядер и
клеточных обломков.
3. Переносят аликвоты полученного супернатанта по 10- 15 мл в
центрифужные пробирки и подслаивают под них по 10 мл раствора,
содержащего 50 мМ трицин-NaOH, pH 7,9, 330 мМ сорбитол, 0,1%-ный БСА и
10%-ный (о/о) свежеотдиализован-ный перколл.
4. Центрифугируют в течение 5 мин прн 4000 g в бакет-ро-торе с подвесными
стаканами, чтобы осадить амилопласты. Осторожно ресуспендируют осадок
амилопластов.
В число маркеров для содержащих строму амилопластов входят
нитратредуктаза, глутаматсинтаза, глюкозо-6-фосфатдегид-рогеназа;
описание способов регистрации этих ферментативных активностей можно найти
в работе [181]. Интактность полученных пластид оценивают по латентности и
устойчивости к обработке трипсином [178, 181].
Судьба мембран разрушенных амилопластов остается неизвестной при
рассмотрении большинства предлагаемых схем фракционирования тканей. В
качестве маркеров для этих мембран используют каротиноиды и галактолипиды
[37, 38], а также способность к биосинтезу галактолипидов [37].
11.6. Хромопласты
Хромопласты образуются в тканях из хлоропластов или амилопластов путем
модификации внутренних мембран и характеризуются высоким содержанием
нефотосинтетических пигментов, в основном каротиноидов. Источником
хромопластов могут служить некоторые растительные ткани, например
лепестки Narcissus pseudonarcissus [182-184] и Tropaeolum majus [185],
плоды Capsicum аппиит [186] и Lycopersicum esculentum [187]. Как правило,
ткань гомогенизируют механически, и грубую фракцию хромопластов очищают
от других клеточных компонен-
Мембранные фракции растительных клеток
99
тов дифференциальным центрифугированием и/или центрифугированием в
градиенте плотности.
Исследованы локализованные в хромопластах ферменты; это связанные с
мембранами ферменты, участвующие в синтезе галактолипидов [183, 185] и
(3-каротена [184].
11.7. Пластоглобулы
Пластоглобулы представляют собой капли, богатые липидами, различимые с
помощью трансмиссионной электронной микроскопии благодаря своей
осмиефильности. Они присутствуют в большинстве типов пластид [188-191].
Из-за своей низкой плотности пластоглобулы обычно собираются на
поверхности градиентов плотности сахарозы после центрифугирования
разрушенных пластид. Выделяют пластоглобулы из грубой фракции
хлоропластов или хромопластов следующим образом [188].
1. Суспендируют пластиды в буфере (1 мМ фосфатный буфер, pH 7,6, 0,1 мМ
дитиоэритреитол) и обрабатывают ультразвуком в течение 5 мин при 20 кГц.
Можно также пропустить суспензию через пресс Френча при давлении 50 МПа.
2. Центрифугируют полученную суспензию в течение 60 мин при 150 000 g в
угловом роторе.
3. Собирают сверху слегка замутненный слой, содержащий пластоглобулы и
агломерат пластоглобул со стенок пробирки и переносят их в 5%-ный раствор
фиколла в фосфатном буфере, pH 7,6.
4. Готовят в центрифужной пробирке ступенчатый градиент для флотации: на
