Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
гликолата. Глиоксисомы тканей, запасающих жиры, содержат ферменты р-
окисления жирных кислот и ферменты глиоксилатного цикла [197-204].
Фракции микротелец, полученные с помощью центрифугирования в градиенте
плотности, редко бывают загрязнены другими органеллами. Впрочем, не
существует и какого-либо определенного способа измерения содержания
небольших количеств примесей во фракции микросом, за исключением
морфологических исследований осадка. Обычные маркеры для идентифика-
102
Глава 2
дии микротелед в очищенных фракциях - каталаза и перокси-даза -
сконцентрированы в микротельцах, но встречаются и во многих других
мембранных фракциях.
14. Окаймленные везикулы
Растительные клетки содержат окаймленные ямки и везикулы [205]. Оба
образования распознаются по ультраструктуре - наличию характерного
клатринового покрова на поверхности плазматической мембраны.
Предполагается, что эти структуры участвуют как в экзоцитозе [206], так и
в эндоцитозе [206, 207].
Для выделения окаймленных везикул из протопластов суспензионной культуры
клеток сои разработан следующий метод [208].
1. Ресуспендируют промытые протопласты в трех объемах среды для
гомогенизации [100 мМ PIPES, pH 6,9, 2 мМ дитио-эритректол, 2 мМ ЭДТА, 1
мМ MgCl2, 0,30 М сорбитол] и гомогенизируют 50 ходами охлажденного
гомогенизатора Даунса с неплотно пригнанным пестиком.
2. Центрифугируют гомогенат 10 мин при 1000 gmaX.
3. Наслаивают супернатант на линейный (15-60%" в/в) градиент плотности
сахарозы в градиентном буфере следующего состава: 45 мМ MES, pH 6,5, 1 мМ
ДТЭ, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ MgCI2 и центрифугируют 3 ч при 140 000gCp в
вертикальном роторе, медленно набирая скорость до 10 000 об/мин и
медленно останавливая ротор.
4. Собирают нижнюю фракцию объемом 2 мл. Разбавляют эту фракцию,
обогащенную окаймленными везикулами (концентрация сахарозы 48-52%, в/в),
двумя объемами градиентного буфера и центрифугируют 70 мин при 75000graax
для осаждения окаймленных везикул.
5. Чтобы очистить обогащенную окаймленными везикулами фракцию, разбавляют
48-52%-ную фракцию градиентным буфером до концентрации сахарозы 10% (в/в)
и наслаивают на линейный 15-25%-ный (в/в) сахарозный градиент.
Центрифугируют 90 мин при 16 000gcp и собирают нижнюю фракцию объемом 1,5
мл. Окаймленные везикулы собираются в полосе с концентрацией сахарозы 16-
18%.
Окаймленные везикулы из протопластов сои содержат главный полипептид с
относительной массой 180-190 кДа [42-44, 208] и обнаруживают активность
глюкансинтетазы I [209].
15. Заключительные замечания
Сейчас мы имеем возможность получать в изолированном виде все компоненты
растительной клетки, хотя и не обязательно из одного гомогената. Оставляя
в стороне это ограниче-
Мембранные фракции растительных клеток
103
ние, отметим, что очень важно проводить исследования с использованием
только тщательно охарактеризованных субклеточных фракций. Необходимо
учесть все основные клеточные компоненты (включая тонопласт и пластиды) и
представить морфологическую картину фракции, проведя электронно-
микроскопический анализ репрезентативной части осадка. По возможности
должен быть представлен весь осадок в виде достаточного количества
препаратов, и все препараты должны быть охарактеризованы для получения
количественных данных. Кроме того, нужно составить таблицы распределения
активностей, как только это представится возможным, для всех маркеров и
клеточных компонентов, которые были зарегистрированы, и оценить выход
активностей. Только таким образом можно в полной мере использовать те
возможности, которые дают методы фракционирования растительных клеток.
Литература
1. Morre D. L, Gripshcver В., Boss W. I., Tuite P. J. (1984). Annals of
the Phytochemistry Society of Europe. Boudet A. М., Alibert G" Marigo G"
Lea P. J. (eds.), Clarendon Press, Oxford, Vol. 64, p. 247.
2. Morre D. J. (1973). In: Molecular Techniques and Approaches in
Developmental Biology. Chrispeels M. J. (ed.), John Wiley, New York, p.
1.
3. Morre D. I. (1971). Methods Enzymol., 22, 130.
4. Mollenhauer H. II., Morre D. J., Kogut C. (1969). Exp. Mol Pathol.,
11,
113.
5. Cunningham W. P., Morre D. J., Mollenhauer II. II. (1966). J. Cell
Biol., 28,
169.
6. Morre D. J., Mollenhauer H. H., Chambers J. E. (1965). Exp. Cell Res.,
38, 672.
7. Morre D. }., Nyquist S., Rivera E. (1970). Plant Physiol., 45, 800.
8. Morre D. J. (1970). Plant Physiol., 45, 791.
9. Kappler R., Kristen U., Morre D. J. (1986). Protoplasma, 132, 38.
10. deDtwe C. (1967). Science, 189, 186.
11. Morre D. I., Cline G. B., Coleman R., Evans It7. H" Glaumann H.,
Headon D. R., Reid R., Siebert G" Widnell С. C. (1979). Eur. J. Cell
Biol., 19, 231.
12. deDuve C. (1964). J. Theor. Biol., 6, 33.
13. Anderson N. G" Harris It7. W., Barber A. A., Rankin С. Т., Jr.,
Candler E. L. (1966). Natl. Cancer Inst. Monogr., 21, 253.
14. Scherer G. F. E. (1984). Planta, 160, 348.
15. Chadwick С. М., Northcote D. H. (1980). Biochem. J" 186, 411.
