Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 43

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 191 >> Следующая

суспензию пластоглобул (на дне) наслаивают 2,5%-ный раствор фиколла в
фосфатном буфере, pH 7,6, и заполняют пробирку 1 мМ фосфатным буфером, pH
7,6. Центрифугируют в течение 90 мин при 250 000 g в бакет-роторе с
подвесными стаканами.
5. Собирают пластоглобулы с верхнего слоя градиента и повторяют
промывание (п. 4 и 5) по меньшей мере шесть раз.
6. Чтобы предотвратить агрегацию пластоглобул, суспензию перед
употреблением слегка обрабатывают ультразвуком.
По поводу состава пластоглобул см. работы [188-191].
12. Ядра и ядерные оболочки
Ядра обычно выделяют из профильтрованного гомогената, полученного путем
измельчения ткани (автоматический резак с бритвенным лезвием, политрон,
ступка и пестик). Для этого гомогенат подвергают низкоскоростному
центрифугированию (500g, 10 мин), а затем наслаивают на 2,3 М раствор
сахарозы и вновь центрифугируют. Ядра проходят через раствор сахарозы
7:
100
Глава 2
за 60 мин центрифугирования при 60 ООО g, тогда как другие мембраны
остаются сверху [192].
Содержание и чистоту ядерных препаратов можно контролировать с помощью
световой и электронной микроскопии. Единственный критерий интактности
состоит в сохранности наружного и внутреннего слоев ядерной оболочки.
Ферментные маркеры для ядер неизвестны (см. также гл. 1). Самым
распространенным источником загрязнений являются ламеллярные и тубулярные
структуры эндоплазматического ретикулума, связанные с наружным слоем
ядерной оболочки. Приемлемый выход ядер из гомогената составляет 20-25%
(от суммарной ДНК). Подробности выделения и характеристики ядер
растительных клеток можно найти в работе [193].
12.1. Ядерные оболочки
Ядерные оболочки растительных клеток уже охарактеризованы [41]. Их
химический и ферментный состав очень близок (а возможно, идентичен) к
составу шероховатого эндоплазматического ретикулума. Интактные ядерные
оболочки или их фрагменты можно идентифицировать с помощью электронной
микроскопии срезов или негативно контрастированных препаратов благодаря
наличию характерного порового комплекса, который связывает внутренний и
наружный слои оболочки.
Приведем стандартный метод выделения ядерных оболочек из растительных и
животных клеток.
1. Суспендируют выделенные в сахарозе ядра в дистиллированной воде. Ядра
быстро набухают, их оболочка разрушается и в среду высвобождаются
хроматин и ядрышки.
2. После мягкой обработки ультразвуком и низкоскоростного
центрифугирования (300 g, 3 мин) для освобождения от обломков и интактных
ядер очищают ядерные оболочки, наслоив суспензию па подложку из 62%-ной
сахарозы (в/о) и отцентрифу-гировав в течение 30 мин при 3000 g.
3. Ядрышки и хроматин осаждаются на дно, а мембраны оболочек остаются на
подложке, с которой их собирают и осаждают центрифугированием [194, 195].
12.2. Хроматин и ядрышко
Чтобы отделить ядрышки от фрагментов хроматина, ядра лизируют тритоном и
затем центрифугируют при 2000g в 30%-ном глицероле. Ядрышки осаждаются, а
хроматин остается в супернатанте [196].
Мембранные фракции растительных клеток
101
13. Микротельца
Микротельца (пероксисомы, глиоксисомы) имеют форму сферы диаметром 0,5-
1,5 мкм. Их характерными особенностями являются наличие одинарной
ограничивающей мембраны, плотной стромы или гранулярного матрикса,
которые выявляются при окрашивании на каталазу; их равновесная плотность
в градиенте сахарозы 1,24-1,26 г/мл [197, 198]. Пероксисомы обычно
выделяют из листьев шпината, а глиоксисомы - из эндосперма клещевины.
Поскольку мембрана, ограничивающая микротельца, оди-нарна, они могут
разрушаться при выделении. Поэтому необхо< димо использовать как можно
более мягкие способы гомогени зации тканей и избегать повторных
центрифугирований и ресус-пенднрований. Для выделения глиоксисом из
эндосперма клещевины можно использовать следующий метод [199].
1. Измельчают ткань эндосперма бритвенным лезвием; на 1 г ткани берут 1
мл среды для гомогенизации следующего состава: 0,45 М сахароза, 150 мМ
трицин-КОН, pH 7,5, 0,1 мМ MgS04, 0,1 мМ KCI, 0.05 мМ CaS04, 0,1%-ный
БСА.
2. Фильтруют гомогенат через нейлоновую ткань.
3. Наслаивают 15-20 мл отфильтрованного гомогената на линейный (15-60%,
в/в) градиент плотности сахарозы, содержащий 2,5 мМ трис-MES, pH 7,2, и
центрифугируют 1 ч при 80 000 g в бакет-роторе с подвесными стаканами.
4. Собирают фракцию глиоксисом (плотность 1,24 г/мл) и медленно
разбавляют ее 10 объемами буфера следующего состава: 13,5% (в/в)
сахарозы, 0,1 мМ MgS04, 0,1 мМ КС1, 0,05 мМ CaS04, 10 мМ трис-MES, pH
6,8, 0,05% БСА.
5. Осаждают глиоксисомы центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин.
Обломки клеток, ядра и интактные пластиды можно удалить из гомогената
эндосперма низкоскоростным центрифугированием (150-500g, 10 мин) и при
необходимости сконцентрировать микротельца центрифугированием в течение
10 мин при 10 000 g перед наслоением на градиент плотности сахарозы
[200].
Помимо каталазы глиоксисомы из листьев содержат ферменты метаболизма
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed