Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
г/мл), а также на наличии латентной ЮРазной активности [26, 39] и
активности глюкан-синтазы I [70] (последняя была описана вначале как
активность с высокой Км для UDP-глюкозы [47]). Методы оценки активности
латентной ЮРазы могут различаться. Первая описанная методика основывалась
на снятии латентности при хранении фракции в течение нескольких суток при
низкой температуре [26]. Этот тип латентности, по-видимому, специфичнее,
чем более обычный, связанный с целостностью структуры, который
характеризуется исчезновением латентности при разрушении мембран под
действием детергентов [39]. Хотя между двумя указанными активностями
существует определенный параллелизм [135], последняя из них обычно
распространена среди клеточных компонентов несколько шире, чем первая.
Из растительных клеток пока удается получить мембранные фракции,
обогащенные аппаратом Гольджи ,не более чем на 50%. Фракция, выделенная
из гипокотилей сои (рис. 2.9) и охарактеризованная морфометрически, а
также по активности ферментов-маркеров, имеет следующий состав: 45%-
мембраны аппарата Гольджи, 15%-плазматическая мембрана, 4%-тонопласт* 1%
- митохондрии, 18%-эндоплазматический ретикулум* 10%-пластиды, 7% -
иеидентифицированный белок [50].
Секреторные везикулы, происходящие из аппарата Гольджи, были выделены из
пыльцевых трубок путем последовательного использования двух методов:
разделения по размерам (нуклео-поровый фильтр) и центрифугирования [136].
Позже была разработана методика, основанная на двухэтапном
центрифугировании, для получения везикул из прорастающей пыльцы [137];
показано, что с мембранами этих везикул ассоциирована р-глю-
94
Глава 2
кансннтазная активность [138-140]. Сравнительно недавно описаны методы
выделения так называемых фракций секреторных везикул из других источников
растительного происхождения {141-143]; правда, полученные фракции плохо
охарактеризованы.
11. Пластиды
Привести какую-либо единую методику выделения пластид невозможно,
поскольку выбор того или иного способа зависит и от типа ткани, и от
стадии развития пластид, подлежащих выделению. Тем не менее мы рассмотрим
несколько методов выделения различных типов пластид и их субфракцнй.
11.1. Хлоропласты
Для получения функционально активных хлоропластов лучше всего
использовать ткани шпината или гороха. Здесь мы вкратце рассмотрим
методику выделения хлоропластов, подробно описанную в работе [144].
Для создания в среде для выделения хлоропластов необходимого
осмотического давления в нее обычно добавляют сорби-тол до конечной
концентрации 0,33 М, хотя можно использовать также различные сахара
(например, сахарозу) и сахарные спирты (например, маннитол). Выбор буфера
также не принципиален, но обычно используют пирофосфат, трис, MES и
HEPES. Чтобы предотвратить агрегацию, в состав среды в малых количествах
можно включить MgCl2 и МпС12, а также неорганический фосфат и/или ЭДТА. В
качестве защитных агентов в среду вносят изоаскорбат и БСА. Чтобы
увеличить выход хлоропластов, перед гомогенизацией листья экспонируют на
ярком свету в течение 20-30 мин.
1. На одну часть листьев с удаленными жилками берут одну часть среды (см.
выше). Измельчают листья в гомогенизаторе типа Уоринга (на полной
скорости, 3-5 с) или с помощью политрона (на низкой скорости, до 3 с).
Время гомогенизации увеличивать нежелательно, поскольку при этом
возрастает число разрушенных хлоропластов.
2. Фильтруют гомогенат (Miracloth, нейлоновая сетка илн прочная ячеистая
ткань) и центрифугируют до 90 с при 6000- 8000 g в роторе с подвесными
стаканами. Часто применяют и другие режимы с более низкими скоростями
центрифугирования, например 1000-2000 g, 20-60 с f36].
3. Отбрасывают супернатант и промывают поверхность осадка небольшим
количеством среды, чтобы удалить разрушенные хлоропласта, находящиеся в
верхнем слое.
Мембранные фракции растительных клеток
95
4. Ресуспендируют оставшийся осадок, обогащенный ннтакт-ными
хлоропластами, в малом количестве среды, слегка вращая пробирку или
помешивая содержимое мягкой кисточкой.
Для дальнейших исследований функций хлоропластов или их состава
полученную фракцию необходимо очистить. Следует иметь в виду, однако, что
хлоропласты, очищенные центрифугированием в градиенте плотности сахарозы,
могут почти полностью потерять способность к фиксации СОг. Более
пригодными оказались методики с использованием скоростного и изопикни-
ческого центрифугирования [145, 146] или разделение по скоростям [147].
Хлоропласты с достаточно хорошо сохранившейся фотосинтетической
активностью удается получить и в градиентах плотности перколла [148-151].
Хорошие результаты дает также применение комбинированных градиентов
перколла, ПЭГа и фиколла [152]. Высокоочищенную фракцию хлоропластов
можно получить с помощью препаративного электрофореза в свободном потоке
[153, 154] или распределения в водной двухфазной системе, содержащей
полимеры [155, 156].
Круг растений, из которых получают функционально активные хлоропласты,
