Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
образец подвергают УФ-облучению, которое активирует фоточувстви-тельные
азидные группировки. Хотя доля образовавшихся при этом сшивок между
лигандом и рецептором значительно ниже (в лучшем случае 1-2%), чем обычно
(20-25%), возросшая специфичность взаимодействия сильно облегчает
интерпретацию полученных результатов. Таким образом можно также
установить, какая субъединица в олигомерном рецепторе несет на себе центр
связывания для белкового или гормонального лиганда.
300
Глава 6
Наиболее полезными для подобных экспериментов оказались бифункциональные
реагенты - производные арилазидов и N-гидроксисукцинимидных эфиров.
Некоторые из них содержали мостики - расщепляемые группировки [143, 144].
В качестве примера здесь приведены два таких реагента:
Ниже представлена типичная методика проведения экспериментов по изучению
взаимодействий между лигандами и рецепторами.
1. Проводят иодирование белкового лиганда по методике, описанной в разд.
6.1.1. Иодированный белок, находящийся в растворе, следует отделить от
других компонентов реакционной смеси центрифугированием или гель-
фильтрацией.
Стадии (2) - (4) следует проводить в темноте!
2. Инкубируют [1251]-лиганд (10-20 мкг) в атмосфере азота в растворе,
содержащем 0,1 мМ бифункционального сшивающего реагента в 0,1 М фосфатном
буфере (pH 7,4), в течение 10-30 мин при 4-25 °С. Реакцию можно
остановить с помощью 1 мМ лизина.
3. Очищают модифицированный [,251]-лиганд гель-фильтрацией на небольшой
колонке (например, с 2 мл сефадекса G-50) в буфере, подходящем для
инкубации с мембранами (клетками).
Убедитесь в том, что константы связывания для модифицированного и
немодифицированного лигандов существенно не различаются.
4.а. Добавляют модифицированный [1251]-лиганд к мембранам в условиях,
используемых при анализе рецепторного связывания (0-37 °С), и оставляют
до установления равновесия. В идеальном случае следует добавить столько
лиганда, чтобы было занято около 50% рецепторных центров, а доля
свободного лиганда составляла 60-70% от всего добавленного его
количества. Этого можно достичь, когда величины /Сд низки (от 10-8 до 10-
9 М), а число рецепторов велико (пояснения см. в работе [117]). Если
связывание является очень прочным,
Выделение и модификация мембранных белков
301
мембраны можно промыть, чтобы снизить уровень неспецифического
связывания, но лучше всего провести контрольный опыт (б) для определения
этого уровня,
б. Проводят параллельную инкубацию, при которой вместе с иодированным
лигандом добавляют также немеченый лиганд, но в большом избытке по
отношению к меченому (по меньшей мере в 200 раз).
5. Облучают контрольный и опытный образцы в атмосфере азота УФ-светом (с
помощью, например, ртутной лампы) в течение 1-10 мин при 4-25 СС. Реакцию
можно остановить добавлением 1 мМ днтиотреитола. Промывают мембраны
(клетки) подходящим буфером.
6. Наличие специфического рецепторного связывания устанавливают с помощью
гель-электрофореза в присутствии ДСН, сравнивая состав меченых и
немеченых белков, полученных в инкубациях (а) и (б).
В тех случаях, когда нельзя получить радиоактивно меченный лиганд, на
стадиях 2-6 можно использовать меченые бифункциональные реагенты,
например [цистеамин-35Б]-М-сукцин-имидил-3-[ (2-нитро-4-азидофенил)-2-
аминоэтилдитио) пропионат {[35S]-SNAP; фирма Amersham). Этот реагент
позволяет идентифицировать не только перекрестно-сшитые комплексы, но и
сам рецептор, который сохраняет метку после обработки комплекса
дитиотреитолом, отрывающим лиганд от рецептора.
Другим реагентом такого типа является Ы-[4-(4/-азидо-3'-[ 1251 ] -
иодфенилазо) бензоил] -З-аминопропил-Ы-оксисукцинимид-ный эфир,
предлагаемый фирмой New England Nuclear. Он расщепляется дитионитом
натрия (табл. 6.8) и поэтому в отличие от реагента SNAP после расщепления
не дает свободных SH-rpynn.
7. Радиационная инактивация
Оценки молекулярной массы мембранных белков, сделанные по результатам
гель-фильтрации и анализа субъединичного состава, полезно дополнить
данными, полученными с помощью методов, которые не требуют солюбилизации
белка. Такую возможность предоставляет радиоинактивационный анализ,
который в определенных случаях может быть единственным или
302
Глава 6
наилучшим способом определения молекулярной массы нативного белка (см.
обзор [178]). Этот метод основан на инактивации белка (т. е. утрате его
биологической активности) in situ под воздействием рентгеновского
облучения. Инактивация зависит (обычно логарифмически) от общей дозы
радиации. В свою очередь эта зависимость прямо связана с размерами мишени
(т. е. с молекулярным объемом функционально активного белка). Простейшее
соотношение имеет вид
Ю11
Молекулярная масса = 6,4-- ,
где D - доза облучения в радах, при которой активность уменьшается до 37%
от исходного уровня. Это уравнение получено эмпирически для
экспериментов, проведенных прн комнатной температуре. Однако мембраны
рекомендуется исследовать в замороженном состоянии, поскольку их
