Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
миелина [140]), то для изучения его молекулярного окружения можно
использовать сшивающие реагенты. Экспериментальные условия при этом такие
же, как и в случае водорастворимых белков; они определяются главным
образом свойствами сшивающего реагента (табл. 6.7). Однако, чтобы
полученные результаты можно было однозначно трактовать, необходимо
выполнить ряд контрольных экспериментов. Во-первых, имеет смысл
использовать расщепляемые реагенты (например, содержащие дисульфидную
связь), потому что возможность снова получить мономерные полипептиды
поможет отличить сшивание от какой-либо неспецифической и необратимой
агрегации, которая может произойти вследствие модификации боковых цепей
аминокислот (табл. 6.8). Следует также провести контрольные опыты с
инактивированным сшивающим реагентом или без него, а еще лучше - с
близким ему по строению монофункциональным реагентом.
Во-вторых, надо иметь в виду, что локальная концентрация белка в мембране
очень высока (так, при концентрации бедка в инкубационной смеси 1 мг/мл
его эффективная концентрация близка к 100 мг/мл). Поэтому частота
хаотических столкновений белка с реагентом соответственно намного выше,
что может привести к значительной неспецифической ассоциации, тем самым
затрудняя интерпретацию результатов. Ситуацию можно несколько упростить,
снизив значения трех переменных - концентрации сшивающего реагента
(например, с величин порядка мМ до мкМ), времени инкубации (например, с 1
ч до 10 мин) и температуры. Степень понижения температуры, конечно, будет
зависеть от активности функциональных групп, но есть определенные
преимущества от быстрого снижения температуры
298
Глава 6
Таблица 6.8. Расщепляемые группировки в сшивающих реагентах
Группировка
Условия
Ссылки
Амидииовая NH Н 1 1 С N R 2 М метиламин pH 11,5 [1731
75%-ный ацетонитрил 3 ч 37 °С
Азо _n=n- 0,1 М дитионит натрия 0,15 М NaCI pH 8,0 30 мин 20-30 °С [174]
Дисульфидная -S-S- 10 мМ дитиотреитол или 2-меркаптоэтанол pH 7,0-8,0
30 мин 4-30 °С
Эфирная о 1! -С-о- 1 М гидроксиламии pH 7-9 25 мМ СаСЬ 1 мМ
бензамидин 3-6 ч 20-40 °С [175]
Гликольиая он он 1 1 -сн-сн- 15 мМ перйодат натрия pH 7,5 (не трис-
буфер) 4-5 ч 20-30 °С [176]
Сульфоновая о II -S- II о 100 мМ NaH2P04 pH 11,5 6 М мочевина 2 мМ
дитиотреитол 2 ч 37 °С [177]
ниже 4°С или по крайней мере ниже температуры фазового перехода
фосфолипидов, благодаря чему можно добиться эффективного "замораживания"
стационарного состояния мембраны.
Интерпретация экспериментов по сшиванию весьма трудна [141]. Чаще всего
проводят анализ олигомерных форм белка, идентифицируемых при
электрофорезе в ПААГ с ДСН. В тех случаях, когда применение более чем
одного реагента указывает на образование димеров и тетрамеров в качестве
преобладающих продуктов, вполне разумно сделать вывод о нативной димерной
(или, возможно, тетрамерной) организации белка. Уменьшение в
геометрической прогрессии содержания диме-
Выделение и модификация мембранных белков
299
ров, трнмеров, тетрамеров, пентамеров и т. д. чаще всего свидетельствует
о мономерной организации белка или о существовании его в виде массивного
агрегата. В том случае, когда единственный белок содержится в мембране в
высокой концентрации, артефактные олигомерные структуры можно получить с
каким-либо одним или двумя бифункциональными реагентами, поэтому важно
проводить эксперименты не с одним, а с несколькими сшивающими реагентами.
Иногда сделанные выводы можно надежно подтвердить, если сначала
растворить мембранный образец в детергенте, сохраняющем функциональную
активность белка (и, как можно предположить, его структурную
организацию), а потом добавить сшивающий реагент. В этих условиях
эффективная концентрация белка и соответственно частота хаотических
столкновений будут снижены, благодаря чему уменьшится и уровень его
неспецифического, "фонового" сшивания [139].
6.4.2. Взаимодействия между лигандом и рецептором
Обработка сшивающими реагентами мембран, предварительно проинкубированных
в равновесных условиях с радиоактивно меченным гормоном или другим
лигандом, позволила успешно идентифицировать многие белки-рецепторы (см.
обзор [142]). При этом экспериментальные условия в целом весьма сходны с
теми, которые применяются при изучении ближайшего окружения белков (разд.
6.4.1), за исключением того, что соотношение рецептор/лиганд должно быть
по возможности максимально высоким. При проведении этих экспериментов
сталкиваются с теми же проблемами "фоновой" модификации, которые были
рассмотрены выше, и поэтому была предложена другая схема постановки
опытов. В этом случае белковый или гормональный лиганд предварительно
метят фоточувст-внтельным гетеробифункциональным реагентом. Если его
способность реагировать с определенным рецептором существенно не
нарушается, то модифицированный таким образом лиганд вводят в мембрану в
темноте в концентрациях, достаточных для взаимодействия со специфическими
высокоаффинными рецепторами. После достижения равновесного состояния
