Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
Кейлина [1], выполненной с помощью простого спектроскопа на летательной
мышце насекомых. Наиболее распространенные кофакторы, участвующие в
окислительно-восстановительных реакциях,- пиридиннуклеотиды (NAD, NADP) и
флавины - флуоресцируют либо в окисленном, либо в восстановленном
состоянии. В фотосинтетических системах, помимо хлорофилла, роль
"встроенных молекулярных вольтметров" играют еще и каро-
Оптическая спектроскопия биологических мембран
309
Таблица 7.1. Хромофоры, используемые для изучения структуры и функции
биологических мембран
Хромофор Способ измерения Получаемая информация Ссылки1')
Эндогенные
Хлорофилл Флуоресценция/ Механизм фото- [49, 50]
/Поглощение синтеза [2, 32]
Каротиноиды2) Поглощение
NADH Флуоресценция/
/Поглощение
Флавопротеины Флуоресценция Электронный [14-161
Цитохромы2> Поглощение транспорт
Гемоглобин2> " Транспорт 02 в тка- [10, 25, 26,
Миоглобии2> " нях 30]
Экзогенные
Акридины2> Флуоресценция pH содержимого [7, 51]
Квен-12) " клеточных ком- [9]
Нейтральный ып ) Поглощение партментов [36, 52, 53]
крсШНЫИ ' Квин-22> Флуоресценция Содержание Са2+ [81
Экворнн, обелин Люминесценция в цитоплазме [54]
Мурексид, арсен- Поглощение [55]
330 Цианины Флуоресценция
Оксонолы2) Флуоресценция / Мембранный по- [3, 13. 311
/Поглощение тенциал
Мероцианины Флуоресценция
Нафталинсульфо- " Поверхностный за- [56-591
наты ряд мембран [43. 601
Дифенилгекса- Флуоресценция Микровязкость [61, 62]
триен
Антроиловые Поляризация Текучесть мембран [63-65]
эфиры
1) Приведенные ссылки не обязательно указывают первые работы, где описано
использование данного хромофора; онн служат скорее источником ссылок,
позволяющим более детально ознакомиться с оригинальной литературой.
2) Более подробно об этих хромофорах говорится в тексте.
тиноиды - вторичные антенные пигменты, поскольку положение их максимумов
поглощения зависит от трансмембранного электрического потенциала [2]. Это
свойство оказалось весьма полезным для изучения механизмов преобразования
энергии при фотосинтезе и стимулировало интенсивные поиски экзогенных
пигментов с аналогичными свойствами, которые можно было бы использовать
для исследования генерации трансмембранного электрического потенциала
другими мембранными системами [3].
Кроме регистрации мембранного потенциала, экзогенные пигменты применяют
для наблюдения за целым рядом характеристик клетки, например за pH
цитоплазмы и содержимого
310
Глава 7
различных органелл, концентрацией Са2+ и Mg2+ в цитоплазме, текучестью
мембранных липидов или микровязкостью, судьбой захваченных из окружающей
среды частиц. В этих случаях краситель выбирают так, чтобы он был: 1)
чувствителен к изменениям регистрируемого параметра; 2) способен
достигать конечного пункта назначения. У индикаторов на плазматический pH
или Са2+ наблюдается характерное изменение флуоресценции или поглощения в
зависимости от концентрации катионов в среде. Способные проникать через
мембрану эфнры этих индикаторов диффундируют внутрь компартмента, где
эндогенные ферменты катализируют их гидролиз с образованием in situ
активной формы индикатора. Диапазон возможных экспериментов с
использованием индикаторов столь велик, что детально описать каждый из
них! практически невозможно. Однако не всегда понимают, насколько просто
можно поставить многие эксперименты, используя лишь доступное для
большинства лабораторий оборудование. Многие методические подходы и
процедуры, которых мы коснемся в этой главе, детально описаны в
практическом руководстве [4] по применению снектро-фотометрии и
флуорнметрпп в биохимических исследованиях.
2. Постановка эксперимента
2.1. Оборудование
Для проведения спектроскопических измерений нужен либо спектрофотометр,
измеряющий поглощение света, либо флуо-риметр, измеряющий флуоресценцию,
либо микроскоп, с помощью которого в принципе можно измерять
флуоресценцию или поглощение единичной клетки или небольшой группы
клеток. При спектро- и флуорнметрических измерениях используют обычно
суспензии мембран, налитые в стандартные кюветы; микроскопические
измерения дают двумерное изображение мазков, срезов или поверхностей.
Флуориметры и спектрофотометры, снабженные волоконно-оптическими
световодами, позволяют исследовать и поверхности. Для этого с помощью
одного световода (пучка оптических волокон) освещают нужный участок
поверхности, а с помощью другого передают отраженный свет или свет,
испускаемый прн флуоресценции, на детектор, обычно фотоумножитель (рис.
7.1). Отраженный свет имеет две компоненты: зеркально отраженный и
диффузно отраженный свет. Информацию (аналогичную поглощению) о
присутствующих на поверхности хромофорах дает только последняя
компонента. При всех типах фотометрии для отделения интересующего
исследователя сигнала от рассеянного света применяют фильтры и/или
монохроматоры.
Оптическая спектроскопия биологических мембран
311
Трансмиссионная Исследования Микроскопические
