Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
иодирование белков за счет окисления I-. Он нерастворим в воде и обычно
наносится в виде пленки на стенки реакционного сосуда. С другой стороны,
иодоген гидрофо-бен, и в принципе может проникать через бислой. Поэтому
он менее удобен в качестве векторного зонда по сравнению с другими
модификаторами.
Методика
1. Смачивают внутреннюю поверхность стеклянного сосуда раствором
иодогена в хлороформе (1 мг/мл) и упаривают растворитель в вакууме или в
потоке азота.
286
Глава 6
2. Добавляют мембраны (1 мг по белку), суспендированные в 1 мл PBS, pH
7,4, и 1 мКи Na[125I] (1 мкг реагента приходится на 10 мкг белка).
3. Инкубируют при 4-25 °С в течение 5-30 мин, периодически осторожно
перемешивая.
4. Останавливают реакцию удалением мембран и промыванием буфером,
содержащим 1 мг/мл БСА.
III. Иммобилизованный хлорамин Т [112]. Метод иодирования остатков
тирозина с помощью хлорамина Т является очень эффективным, но в то же
время и довольно жестким. Наиболее нежелательные действия этой обработки
можно ослабить, используя гранулы Iodo-Beads (крупные полистирольные
гранулы, модифицированные N-хлорбензолсульфонамидом; Pierce). Таким путем
удается достичь вполне удовлетворительной векторной модификации. Этот
реагент можно использовать в присутствии азида, тогда как 2-
меркаптоэтанол сильно подавляет его активность. Для проведения реакции
рекомендуются следующие условия:
5-500 мкг белка на гранулу;
0,1-0,2 М фосфатный буфер, pH 7,0-7,4 (трис-буфер действует как слабый
ингибитор);
1 мКи Na[125I];
общий объем - до 1 мл на гранулу;
инкубация при 4-25 °С в течение 10-30 мин.
IV. 3,5-Дииод-4-диазобензолсульфонат (ДДИС). При модификации по
методикам, описанным в разд. I-III, иодируются в основном остатки
тирозина. Может оказаться, что число таких остатков ограниченно или
модификация тирозина приводит к утрате биологической активности. В таких
случаях можно использовать агенты с более широкой специфичностью [110].
Очень полезным здесь является реагент ДДИС, который реагирует с остатками
лизина, гистидина, цистеина, а также тирозина, причем условия реакции
легко модифицировать так, чтобы обеспечить сохранение функциональной
активности белка.
Условия проведения реакции (см. [90] и цитированную там литературу):
мембраны в концентрации до 2 мг белка в 1 мл;
0,1-0,2 М фосфат натрия, pH 7,4;
до 1 мМ [1251]-ДДИС (5 Ки/моль), что отвечает примерно 100-кратному
избытку по отношению к белку;
инкубация при 4-25 °С в течение 5-30 мин.
Реакцию можно остановить, добавив в большом избытке (в 100 раз, например,
10 мМ) гистидин и отмыв мембраны от детергента центрифугированием и
ресуспендированием в фосфатном буфере.
Выделение и модификация мембранных белков
287
V. N - Сукцинимидил - 3(4 - гидроксифенил) пропионат [106, 107]. Это
соединение (реагент Болтона и Хантера) или его водорастворимое
сульфированное производное (Pierce) можно приобрести в иодированной форме
или иодировать самим с помощью хлорамина Т (Amersham). Он ковалентно
присоединяется по аминогруппам через сукцинимидную сложноэфирную
группировку в мягких условиях (например, фосфатный буфер, pH 7,0-7,5, 10-
100-кратный избыток, инкубация при 0-30°С в течение 10-30 мин),
необратимо иодируя при этом белки (см. табл. 6.4 и 6.7). Однако
иодирование может сопровождаться значительной модификацией белка, поэтому
следует тщательно контролировать условия реакции, чтобы сохранить его
биологическую активность.
6.1.2. Углеводы клеточной поверхности
Если модификация полипептидной цепи белков клеточной поверхности
нежелательна, то с помощью существующих методов можно ввести метку в их
углеводные боковые цепи. Для этого лучше всего использовать
галактозооксидазу. Она окисляет концевые остатки галактозы до
соответствующего 6-альдегида, после восстановления которого посредством
NaB[3H]4 регенерируют исходную галактозу, но уже содержащую тритие-вую
метку [114]. Некоторые исследователи предпочитают использовать КВ[3Н]4
из-за его большей устойчивости при хранении.
1. В 1 мл буфера PBS (pH 7,4) инкубируют мембраны (клетки) в количестве 1
мг с 10-20 ед. галактозооксидазы при 25-37 °С при осторожном
перемешивании.
2. Промывают мембраны (клетки) три раза тем же буфером, используя такие
условия центрифугирования, которые не разрушают клетки.
3. Ресуспендируют мембраны (клетки) в фосфатном буфере, добавляют 1 мКи
NaB[3H]4, растворенного в 10 мМ NaOH, и инкубируют при 25 °С в течение 30
мин при осторожном перемешивании.
4. Осаждают центрифугированием и ресуспендируют, как описано выше.
Необходимо провести контрольную инкубацию в отсутствие галактозооксидазы,
поскольку NaB[3H]4 может модифицировать некоторые боковые заместители
полипептидной цепи (например, сульфгидрильные группы).
Концевые остатки галактозы в углеводной цепи можно заново получить или
увеличить их число с помощью предварительной обработки нейраминидазой (1
ед. в условиях, описанных выше). С другой стороны, остатки самой сиаловой
