Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
реакционноспособных групп (гомобифункциональные реагенты), так и разных
групп (гетеробифункциональные реагенты). Они различаются по степени
гидрофобности и по длине мостика, соединяющего между собой активные
группировки. В определенных условиях эти мостики могут подвергаться
разрыву. Имеющиеся в продаже реагенты можно найти в каталогах фирм
Amersham, Calbiochem и Pierce.
Бифункциональные реагенты обычно хранят при -20 °С в безводных условиях,
поскольку многие из них химически неустойчивы в водной среде. Их можно
добавлять к реакционной смеси в буфере, этаноле или диметилсульфоксиде. В
конце эксперимента избыток реагента следует дезактивировать и удалить
путем промывания мембран. Целью многих экспериментов является
установление наиболее тесных контактов между отдельными белками, поэтому
можно рекомендовать начинать исследование с реагентов, способствующих
образованию дисуль-
19*
Таблица 6.7. Сшивающие реагенты
Специфичность
Реагенты/реакция
Пояснения/условия
Ссылки
Аргинин
. NH ч
V-NH-C-NHj/
О О
7 \у-с-с-н Фенилглиоксали
ОН ---
-> r-nh-c^n_cH -
NH
II
R-NH-С - NH2
I I н он
Аспарагиновая -n=c=n- Карбобиимиды
и глутаминовая
нислоть/
н о
(-соон)
R-NH; + HOOC-R,
• R-N-C-R.
f Глутамин
Катализируется транс - глутаминазои
° -Я *}
II И I
R-C-NH, + NHj-R, > R-С -N -R, + NH3
pH 7-8, но продукт разлагается при нейтральных или щелочных pH мМ
30-60 мин 20-30 °С
Катализируют образование пептидной связи с эндогенными и экзогенными
аминосодержащими соединениями pH 4,5-7,0 мМ
30-60 мнн 20-30 °С
pH 7,4 25-37 °С 1-18 ч
[145, 146]
[147]
[95, 148]
Цистеин о ' Ацилгалогениды или
х_с-сн-вг<1) амино га логе н иды
(-5н)
R - SH ¦
(свободная или образующая
СЯ при вое- N N
с тановле- I \и нии)
'N N
¦.к Л v.
-> R-S -CHj-С -X
Компленс 1,10-фенан-тролина с медью р
R-SH + SH-R,->r-s-S-R.
X-N^
О
R-SH ¦
X-S-N
CS.
Малеимиды
о
N-X
Дает дисульфидные связи с тиофтальимц -да ми
pH 7-9 чкМ-мМ 4-25 °С, до 2 ч
pH 7-9
До 100 мкМ фенаитро-лииа вместе с 10 мкМ CuS04 0-25 °С, 5-
20 мин
Индуцирует образование дисульфидной связи из удобно расположенных
сульфгидриль-ных групп Реакцию останавливают с помощью 1 мМ ЭДТА
pH 7-9 мкМ 0-40 °С 10-60 мин
В жестких условиях будет реагировать с лизином и гистидином
[156]
[119, 149]
[150]
[151, 152]
Продолжение
Специфичность
Реагенты/реакция
Поясиени я/условия
Ссылки
X-S-S-+V.
Л иридия due у ль фиды
R-SH
-> R-S-S-X
(-NH,)
'/ Vn.
Арилазидь/
R,
R-NH.
-U/ ^
R! H.OH.NO,
4 NO,
R -NH, ¦
NO,
->R-N-
А рилгало?рниг)ы
pH 8 mkM 4-40 °C 1 - 18 ч
pH 8,0 mkM
0-40 °C, 10 мин - 1 ч Синтез см. в [1541 Реагирует также с остатками
триптофана [1551
pH 7-9
мМ
От - 100 до +25 °С 10-60 мин
Добавляют в темноте, облучают при >300 нм
pH 7-9
мкМ 0-40 °С Были также использованы для перекрестно го сшивания
фосфолипидов
[153, 1561
[151, 1531
[138, 152, 154-160]
[139 162, 163]
Диазотрифториды
> ?
N-Гидроксис укцинимид-ные эфиры, fi= -S03Nz для водорастворимых
сульфонатов
о
к н||
-> R-N-C-X
Имидатьу
pH 7,0-8,0 мкМ
Облучают при 254 нм в течение 2 мин при 4 °С
Имеют широкую специфичность, включая, например, SH-группы
pH 6-9, гидролиз проходит в некоторой степени при щелочных pH.
мкМ, избыток в 10- 100 раз по отношению к аминогруппам.
0-30 °С 10-30 мин
Добавляют в этаноле, ацетоне или ДМСО. Конечная концентрация растворителя
должна быть не выше 1%- Синтез см. в{170]
pH 8-10, быстро гидролизуются прн ней тральных pH. мкМ или по меньшей
мере избыток в 100 раз по отношению к аминогруппам.
0-40 °С, намного более активны при повышенных температурах.
10-60 мин
[125]
[139, 164-169]
[139, 168, 171]
Продолжение
Специфичность
Реагенты/реакция
Пояснения/условия
Ссылки
/ '\V-N=C=S
Изотиоцианаты
R -NH ¦
-> R-N-C-N-(c) -X
Реселснтив'Ю с г
-<а
Трифтордиазирины
pH 7-9, но нестабильны при щелочных pH.
мкМ-мМ 0-50 °С 5-30 мин
pH 7,0-8,0 мМ
4-40 °С, до 30 мин. Реагируют также с аминами и тиоламп
pH 6-8 мкМ
0-37 °С, до 20 мин. Активируют облучением при 350 нм. Наибольшее сродство
к нуклеофилам
[104]
[103, 1721
[1171
Тирозин/ f/ \_N+cr Диазобензолы
Гистидин х
Выделение и модификация мембранных белков
297
фидных (Cu-фенантролин) и пептидных (карбодиимид, транс-глутаминаза)
связей, или с реагентов с очень коротким расстоянием между активными
функциональными группами (например, дифтординитробензол [139]).
Результаты применения этих реагентов с цепью так называемой "нулевой
длины" будут определять необходимость использования других сшивающих
реагентов с более длинной и гибкой цепочкой и с разной специфичностью. В
табл. 6.7 указаны условия, при которых можно применять эти реагенты.
6.4.1. Анализ ближайшего окружения белка
Если белок удается идентифицировать методом электрофореза в ПААГ с ДСН,
либо с помощью специфических меток (обычно ковалентного типа), либо
благодаря тому, что он индивидуален или присутствует в мембране в смеси с
немногими другими белками (как, например, родопсин [139] или белки
