Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 127

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 121 122 123 124 125 126 < 127 > 128 129 130 131 132 133 .. 191 >> Следующая

применением флуореска-мина. Как правило, в качестве стандарта
используется сывороточный альбумин, хотя при этом возможны и некоторые
отклонения от обычных количественных соотношений.
5.2.1. Флуорескамин
1. Добавляют к образцу 0,2 М борат натрия с pH 9,0-9,5 (в случае белков)
или 8,0-9,0 (в случае пептидов), так чтобы объем смесн составил около 2
мл, а концентрация буфера была не менее 0,1 М.
2. Добавляют 0,5 мл раствора флуорескамина в ацетоне (0,2 мг/мл);
тщательно перемешивают.
3. Оставляют на 10 мин при комнатной температуре и затем измеряют
флуоресценцию при 480 нм; длина волны возбуждающего света 390 нм.
4. Чувствительность можно повысить, если провести гидролиз белка/пептида
с помощью NaOH (см. ниже ручной нингидриновый метод), нейтрализовать
смесь уксусной кислотой и затем добавить боратный буфер до pH 9,0.
5.2.2. Ммкрометод Лоури [80]
1. К 200 мкл раствора белка в детергенте добавляют 1 мл -
свежеприготовленного реагента Лоури (по 1 мл 2,0%-ного тартрата
натрия/калия и 1%-ного CuS04 в 100 мл 0,1 н
278
Глава 6
Таблица 6.3. Методы количественного определения белка
Метод Пределы измерения Пояснения
Погчощенне при 280 нм 0,1-3 мг Мешают определению ароматические
заместители и некоторые УФ-поглощающие детергенты, например тритоны. В
целом метод дает грубую оценку.
Поглощение при 212 нм 1 мкг - 1 мг Основан на УФ-поглощенип
пептидной группы, поэтому чувствителен и дает сравнительно стабильные
результаты. Но они могут значительно искажаться, например, в присутствии
кислот.
Биуретовый микрометод 0,1-1 мг Основан на реакции с участием пептидных
групп, поэтому слабо зависит от состава белка. В присутствии детергента
реакционная смесь мутнеет: для устранения этого эффекта можно добавить
1.2-пропандиол [82].
Метод Бредфорд 1-100 мкг Несколько зависит от состава белка, поскольку
основан на реакции с участием аминогрупп. Детергенты могут мешать
определению. В некоторых случаях более чувствительны и практически
приемлемы модификации этого метода [83].
Реакция с [?Н] -дансилхлоридом 0,1-1 мкг Реагент взаимодействует с
аминами, фенолами. тиолами и нмидазолами. Метод чувствителен, но
отличается длительной и сложной процедурой анализа. Некоторые детергенты
могут мешать анализу [84].
Реакция с флуоре-скамином 0,1-50 мкг Наблюдается флуоресценция при
реакции с первичными аминами в щелочных условиях. Метод сравнительно мало
чувствителен к посторонним примесям; он довольно прост и требует мало
времени.
Микрометод Лоури 1-50 мкг Несколько зависит от природы белка.
Детергенты. мешающие определению, можно солюбилизировать ДСН [79].
Реакция с нингид-рином 1-50 мкг Не зависит от природы белка, так как
белки расщепляются до аминокислот. Определению может мешать высокое
содержание детергентов. Требует много времени [77].
Метод ВСА (Pierce) 0,5-50 мкг Очень чувствителен, удобен и
сравнительно мало чувствителен к присутствию посторонних веществ.
Выделение и модификация мембранных белков
279
NaOH, содержащего 2% На2СОз), тщательно перемешивают и оставляют на 10
мин.
2. Добавляют 10%-ный ДСН до конечной концентрации 1% и тщательно
перемешивают.
3. Добавляют 100 мкл разбавленного в два раза реагента Фолина - Чикольте
и сразу же перемешивают.
4. Не раньше, чем через 30 мин и не позднее, чем через 2 ч, измеряют
оптическую плотность при 660 нм.
5.2.3. Микрометод Лоури В [81]
Поскольку не все детергенты растворяются в ДСН (например, ЦТАБ), можно
использовать альтернативную процедуру, включающую осаждение белка.
1. Добавляют 30 мкл 1%-ного раствора дезоксихолата к раствору белка (25
мкг в 5-200 мкл).
2. Добавляют 1 мл холодной 12%-ной трихлоруксусноп кислоты.
3. Инкубируют 10 мин. Центрифугируют при lOOOg' в течение 20 мин.
4. Добавляют 1 мл реагента Лоури к осадку и солюбилизируют (10-15 мин).
5. Добавляют 100 мкл разбавленного в два раза реагента Фолина -
Чикольте и сразу же перемешивают.
6. Через 30 мин измеряют оптическую плотность при 660 нм.
5.2.4. Ручной нмнгидриновый метод
1. Высушивают образец в полипропиленовых пробирках.
2. Добавляют 0,15 мл 9 М NaOH и инкубируют 90 мин при 110°С.
3. Осторожно добавляют 0,25 мл ледяной уксусной кислоты, пока образцы еще
остаются теплыми.
4. Добавляют 0,5 мл свежеприготовленного нингидринового реагента (2 г
нингидрина, 40 мг SnCl2 в 75 мл 2-метоксиэтано-ла и 25 мл 4 М ацетата, pH
5,5, при продувании N2) и инкубируют при 100°С в течение 15-20 мин.
5. Охлаждают, добавляют этанол до 2,5 мл и измеряют оптическую плотность
при 570 нм.
6. Ковалентная модификация белков
Ковалентную модификацию боковых цепей отдельных аминокислотных остатков
можно использовать для того, чтобы облегчить очистку тех мембранных
белков, которые не удается пометить специфическими лигандами, или для
того, чтобы изу-
280
Глава 6
чить топографическое расположение полипептидной цепи в мембране. Многие
из тех реагентов, которые были предложены для водорастворимых белков,
можно использовать и для интегральных мембранных белков. В табл. 6.4 и
Предыдущая << 1 .. 121 122 123 124 125 126 < 127 > 128 129 130 131 132 133 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed