Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 131

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 191 >> Следующая

кисло-
288
Глава 6
ты можно пометить путем обработки мембран боргидридом после
предварительного воздействия на них 1-2 мМ метапе-риодатом натрия в
фосфатном буфере (pH 7,4) в течение 5- 10 мин при 0-20 °С [115, 116].
Реакцию окисления останавливают добавлением глицерола (100 мМ) в буфере,
мембраны промывают и восстанавливают [3Н]-боргидридом, как описано выше.
6.2. Гидрофобные реагенты
Реагенты этого класса (табл. 6.5; обзор [117]) были специально предложены
для изучения мембран. Цель состояла в том, чтобы включить неактивный
реагент в бислой и уже затем получить из него реакционноспособные
частицы, которые будут вступать в реакцию только с теми компонентами,
которые находятся внутри мембраны. Обычно такой реагент активируют
облучением, однако при этом следует позаботиться о том, чтобы не нарушить
функциональную активность мембран. Поэтому предпочитают проводить
облучение светом с длиной волны >300 нм. Наиболее важными
характеристиками реагентов этого типа являются гидрофобность и
реакционная способность. Поскольку во многих случаях задача состоит в
том, чтобы специфично пометить и по возможности идентифицировать боковые
цепи аминокислот, находящиеся в контакте с углеводородной фазой бислоя,
то для предотвращения связывания метки с поверхностью мембраны в водную
среду часто добавляют вещества, улавливающие реакционноспособные частицы.
Наиболее эффективны в этом отношении тиолсодержащие соединения, такие,
как цистеин и восстановленный глутатион. Однако их применение иногда
приводит к тому, что получаемая информация оказывается неполной,
поскольку эти вещества-ловушки могут конкурентным образом предотвратить
мечение той области мембраны, которую занимают полярные головки фосфоли-
пидных молекул.
Недавние исследования показали, что азиды и диазирины (являющиеся
предшественниками нитренов и карбенов соответственно) из-за различий в
своей реакционной способности дают информацию разного рода. Продукты
активации менее реакционноспособных азидов (табл. 6.5) атакуют
преимущественно нуклеофильные группы, в особенности остатки цистеина и
тирозина (возможно, также метионина) и в меньшей степени остатки
триптофана, лизина и гистидина [120, 121]. Их способность реагировать с
углеводородными боковыми цепями очень ограничена. С другой стороны,
продукты активации диазири-нов хотя и реагируют предпочтительно с
нуклеофильными остатками, вступают в реакцию также и с углеводородами
[128].
Выделение и модификация мембранных белков
289
Поэтому указанные реагенты, и особенно 3-трифтор Метил-S'(л!-
иодфенил)диазирин (ТИД), лучше всего подходят для неизбирательного
введения меток в мембрану [127]. В тех случаях, когда мечение настолько
интенсивно, что при секве-нировании белка из-за высокого фона
затрудняется однозначная идентификация включения метки, лучше для
проведения модификации использовать азиды.
При активации УФ-светом азиды и диазирины разлагаются с образованием в
качестве активных частиц соответственно нит-ренов и карбенов. При этом
образуется ряд продуктов - азири-ны и диазопроизводные, иногда тоже
достаточно реакционноспособные (в случае реагента ТИД это не так).
Поскольку многие из активированных промежуточных продуктов имеют
повышенную гидрофильность и сравнительно большое время жизни, не
исключена их диффузия к поверхности мембраны. Для ее предотвращения можно
проводить фотоактивацию ниже температуры фазового перехода липидов.
Однако охлаждать образец следует очень быстро, чтобы не произошла
агрегация белка [120, 121]. Описание типичной методики приведено в табл.
6.6. Чтобы ознакомиться с ее различными вариациями, имеет смысл
просмотреть приведенные ссылки. Рекомендуемые в них контрольные опыты
могут оказаться чрезвычайно полезными.
6.3. Амфифильные реагенты
Эта группа включает такие реагенты, как 12-(4-азидо-2-
нитрофенокси)стеароилглюкозамин [123], который встраивается в бислой так,
что его сахарный остаток находится у поверхности мембраны. Если мембраны
замкнуты, то реагенты этого типа, как полагают, сначала находятся только
в наружном монослое мембраны, но со временем они переходят (правда,
довольно медленно) в ее внутренний слой. Следует позаботиться о том,
чтобы реагенты такого типа не проявляли детер-гентных свойств.
В тех случаях, когда удается провести реконструкцию мембран с исследуемым
белком (или белками), определенные преимущества дает использование
фосфолипидов, содержащих фотоактивируемые группировки в полярной головке
[132], в остатке глицерола [132] или в жирнокислотных цепях [134- 136].
Эти молекулы остаются мембраносвязанными (т. е. не переходят в водную
фазу в заметном количестве), но не следует полагать, что положение
фоточувствительной группы в бислое будет при этом оставаться строго
определенным и статичным. Благодаря динамичности мембран эта группа может
находиться в бислое на разной глубине. Поэтому использование
19-1488
290
Глава 6
Таблица 6.6. Модификация фоточувствительными гидрофобными реагентами
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed