Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 141

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 135 136 137 138 139 140 < 141 > 142 143 144 145 146 147 .. 191 >> Следующая

спектроскопия поверхности исследования
Источник
света
Источник
света
ФЭУ
ФЭУ
? Фильтр
Световод
ФЭУ
Рис. 7.1. Использование волоконной оптики для спектроскопических
исследований биологических объектов. На схеме изображены три способа
регистрации поглощения или флуоресценции. А. Свет подводится к образцу с
помощью гибкого световода, длина которого может достигать 2 м. Свет,
прошедший через образец, собирается вторым световодом и передается на
фотоумножитель (ФЭУ). Свет с нужным диапазоном длин волн "вырезается" с
помощью фильтров, пропускание которых лучше, чем монохроматоров. Когда
записываются спектры, фильтры заменяют монохроматорами. Для измерения
поглощения нужен только один светофильтр, который помещают в положение 1
или 2; при измерении флуоресценции фильтр 1 должен пропускать только
возбуждающий свет, а фильтр 2 - только испускаемый. Очень важно убедиться
в том (несмотря на все заверения и гарантии фирмы-изготовителя), что в
отсутствие флуорофора никакой сигнал не регистрируется! Если
интенсивность флуоресценции мала, возбуждающий свет, прошедший через
фильтр 2, может полностью маскировать флуоресценцию. Чтобы предотвратить
попадание на фотоумножитель постороннего света, все измерения необходимо
проводить в темной комнате. Б. В этом случае измеряются оптические
параметры поверхности образца. Все замечании, высказанные по поводу схемы
А, справедливы и при такой постановке эксперимента. При этой схеме можно
регистрировать флуоресценцию и/или отражение. Раздвоенные световоды
имеются в продаже; их делают либо из случайным образом смешанных и
соединенных в общий конец волокон двух световодов (наиболее удобный
вариант), либо соединяют с одного конца два световода. Более сложные
конструкции описаны в работах [25, 37, 66]. В. В таком варианте световод
располагают вплотную к окуляру микроскопа. Чтобы посторонний свет не
попал на ФЭУ, световод с помощью латунной муфты плотно прижимают к
окуляру.
312
Глава 7
Таблица 7.2. Последовательность операций для определения экспозиции с
помощью присоединенной к флуоресцентному микроскопу автоматической
фотокамеры
1. Выбирают и устанавливают на шкале фотокамеры подходящую
чувствительность пленки (ASA/DIN). Чем больше выставленная
чувствительность пленки, тем больше чувствительность автоматического
экспонометра; экспозиции 20 с при ASA 100 соответствует 10 с при ASA 200.
2. Выбирают подходящее поле зрения, используя трансмиссионную илн фазо-
во-контрастиую аппаратуру.
3. Переключают микроскоп на флуоресцентную оптику.
4. С помощью камеры определяют время экспозиции. Для этого включают
секундомер одновременно с открытием шторки и выключают, как только слышат
щелчок, сопровождающий закрытие шторки. Если полученное время экспозиции
меньше 10 с, устанавливают меньшее значение чувствительности пленки, а
если больше 100 с, то более высокое значение ASA.
5. Повторяют этапы 1-4 не менее пяти раз, каждый раз случайным образом
выбирая поле зрения.
6. Среднее время экспозиции (скорректированное с учетом установленной
ASA) обратно пропорционально интенсивности флуоресценции изображения.
Используя световоды, можно "переоборудовать" микроскоп в фотометр или
флуориметр; для этого свет из окуляра собирают с помощью световода и
передают на соответствующий детектор. Световод закрепляют с помощью
плотно пригнанной латунной муфты, чтобы исключить попадание комнатного
света. Другой способ измерения интенсивности светового потока от
изображения основан на использовании фотометрирующей системы,
присоединенной к микроскопу фотокамеры. Правильно выбранное время
экспозиции пленки заданной чувствительности (ASA/DIN) обратно
пропорционально яркости изображения; для клеток, интенсивность
флуоресценции которых вдвое выше, чем у контрольных, требуется и вдвое
меньшая экспозиция. В некоторых случаях (например, при работе на
микроскопе Leitz Orthomat) фотометрирующая система может работать и без
пленки. Время экспозиции, представляющее собой интервал между моментами
открывания и закрывания шторки, определяют по секундомеру. Для аккуратных
измерений это время должно лежать в диапазоне 10--100 с; более короткие
времена трудно измерить, а при более длительных экспозициях значительный
вклад вносят попадающий в объектив паразитный свет (обсуждение его роли
см. в разд. 2.4.1) и засветка. Общая процедура определения экспозиции
описана в табл. 7.2. Зависимость обратного времени экспозиции от
интенсивности носит линейный характер в очень широком диапазоне
параметров \4], т. е. время экспозиции обратно пропорционально
интенсивности испускаемого света. При большом увеличении обычно
наблюдается фотовыцветанне, проявляющееся в зависящем от времени
Оптическая спектроскопия биологических мембран
313
уменьшении интенсивности. В этом случае нужно уменьшить экспозицию и
свести к минимуму время освещения данного поля объекта.
2.2. Выбор хромофора
Прежде всего нужно выбрать хромофор, приемлемый для решения поставленной
Предыдущая << 1 .. 135 136 137 138 139 140 < 141 > 142 143 144 145 146 147 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed