Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
успешным.
2. Солюбилизация мембранных белков
Структурная классификация белков, о которой мы только что говорили, легко
объясняет особенности их поведения при выделении. Периферические белки
удается солюбилизировать, почти не нарушая целостности мембраны, тогда
как выделение
252
Глава 6
интегральных белков обычно требует ее разрушения. Общие принципы и методы
солюбилизации интегральных мембранных белков с помощью детергентов или
хаотропных агентов уже рассматривались в предыдущей главе, и поэтому мы
обсудим их здесь лишь вкратце. Следует, однако, отметить, что перед
солюбилизацией интегральных белков часто бывает полезно удалить
периферические белки, особенно если предусматривается последующее
фракционирование выделенных белков.
2.1. Периферические белки
В зависимости от задачи, которая стоит перед исследователем, мембрана
может быть подвергнута мягкой или жесткой обработке.
При мягких условиях обработки используют как растворы с низкой ионной
силой (например, 0,1-1 мМ ЭДТА, который удаляет двухвалентные катионы [1,
2]), так и буферы с высокой ионной силой, содержащие NaCI и КС1 в
концентрации более 1 М [2, 3], с добавлением ЭДТА или без нее. Не следует
вводить в эти растворы такие анионы, как ноднд или дииодсалици-лат,
поскольку они обладают хаотропнымн свойствами и могут действовать подобно
детергентам. pH среды может меняться в пределах от 6,0 до 8,0. В этих
условиях необратимая денатурация интегральных или периферических белков
маловероятна.
При более жесткой обработке из мембран можно удалить значительные
количества белка (>50% от его общего содержания в мембранах), но, с
другой стороны, такая обработка обычно приводит к денатурации, во многих
случаях необратимой. В качестве примера можно привести обработку мембран
6 М гуанидинийхлорндом [4J, 8 М мочевиной, 1 мМ л-хлормер-курибензоатом
[5], разбавленными кислотами (pH 2,0-3,0) [6] или щелочами (pH 9,5-11,0)
[7]. В кислых условиях иногда наблюдается осаждение солюбилизированных
белков, и поэтому чаще прибегают к щелочной обработке.
Необходимо иметь в виду, что в результате удаления значительных количеств
белка мембрана может морфологически измениться, в частности может
произойти ее выворачивание или замыкание в везикулы. Поэтому следует так
подобрать условия последующего центрифугирования, чтобы гарантировать
полное осаждение мембран (гл. 1). Если используется кислотнощелочная
обработка, следует как можно быстрее вернуть pH к исходным нейтральным
значениям.
2.2. Интегральные белки
Принципы и методы солюбилизации мембран с помощью детергентов и
хаотропных агентов изложены в гл. 5. Важно отметить, что при такой
обработке могут высвобождаться или акти-
Выделение и модификация мембранных белков
253
вироваться протеазы. Поэтому нередко на этой стадии приходится добавлять
ингибиторы протеаз, даже если они уже были введены на предыдущих этапах
выделения мембран. Существуют разные и довольно сложные смеси
ингибиторов, которые-можно использовать в зависимости от чувствительности
системы к действию цротеолитических ферментов. Весьма полезным, но не
универсальным агентом является ингибитор сериновых протеаз,
фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ). Этот реагент хранят в концентрации 100
мМ в изопропаноле или этаноле и добавляют в инкубационную среду до
концентрации 100 мкМ. Следует помнить, что он имеет довольно короткое
время жизни в водных средах (110 и 35 мин соответственно при pH 7,0 и 8,0
и 25 °С [8]). Для ингибирования SH-протеаз может оказаться полезным 10 мМ
тетратионат натрия. Сведения о других ингибиторах (специфичности и
области применения) можно найти в гл. 1 (табл. 1.3).
2.2.1. Распределение в двухфазной системе
Своеобразный, иногда очень полезный подход к разделению интегральных и
периферических белков основан на их распределении в двухфазной системе.
Этот метод оказался особенно успешным, когда применяли тритон Х-114 [9J.
Чтобы получить как можно более гомогенный препарат тритона Х-114,
проводят следующие операции.
1. Добавляют 10 г тритона Х-114 и 8 мг бутилз а мешенного гидрокснтолуола
к 20 мМ раствору фосфата калия (pH 7,5), содержащему 0,15 М КС1, так
чтобы конечный объем смеси составил 200 мл.
2. Охлаждают смесь до 0 °С, чтобы удостовериться в полном растворении
компонентов, и затем инкубируют ее в течение ночи при 35 °С.
Очищенный детергент при температурах выше 20-25 °С дает отдельную фазу
меньшего объема, которую можно выделить мягким центрифугированием и
подвергнуть, если необходимо, повторной обработке. Солюбилизацию мембран
проводят следующим образом.
1. При 0-4°С добавляют тритон Х-114 до концентрации 2% к мембранному
препарату (1-3 мг/мл по белку) в 10 мМ трис-НС1 или в фосфатном буфере
(pH 7,4), содержащем 150 мМ NaCI или КС1.
2. Инкубируют смесь при 0-4 °С в течение 1 ч и затем центрифугируют (100
000 g, 1 ч) для удаления нерастворившегося материала.
3. Раствор наносят на слой забуференной 6%-ной сахарозы в центрифужной
