Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
последующее фракционирование. Последняя система растворителей
(обозначаемая английской аббревиатурой FACE) особенно полезна при
солюбилизации ин-тактных мембран. Ее лучше всего добавлять к плотному
осадку
•256
Глава 6
мембран, содержащему лишь небольшое количество влаги, которая легко
переходит в растворитель. В обеих системах этанол можно заменить
метанолом, однако следует учитывать, что се-фадекс LH, который можно
использовать с этими смесями растворителей, лучше упаковывается в
присутствии этанола. Уксусная кислота необходима для того, чтобы
предотвратить разделение фаз прн стоянии. Имейте в виду, что многие
интеграль-•ные мембранные белки после солюбилизации и фракционирования в
этих системах плохо переходят в водные растворы, содержащие все
детергенты, кроме ДСН; используя же этот детергент, можно достичь
довольно хорошей солюбилизации. Рассмотрим теперь способы очистки
экстрактов.
3. Хроматографическое разделение белков
Периферические белки, извлекаемые из мембран в условиях, описанных выше,
ведут себя как обычные водорастворимые белки и их можно фракционировать с
помощью стандартных приемов, которые основаны на различиях белков по
размеру, заряду и специфичности взаимодействия с лигандами. Эти методы
детально описаны в других книгах данной серии, посвященных ВЭЖХ и
аффинной хроматографии. Здесь мы рассмотрим глав-гным образом специальные
методы, применимые в первую очередь для разделения мембранных белков и
пептидов. Тем не менее многие описанные здесь методики и системы
растворителей с некоторыми изменениями или даже без таковых легко можно
использовать и для фракционирования периферических белков.
3.1. Разделение по размеру
Если изучаемый белок стабилен, то фракционирование имеет смысл начать с
гель-фильтрации в водном буфере, содержащем детергент в концентрации,
равной или превышающей критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ).
Интегральные белки, окруженные мономолекулярной "шубой" детергента, могут
иметь кажущуюся молекулярную массу, вдвое превышающую ту, что отвечает их
аминокислотной последовательности. Кроме того, многие белковые комплексы
не подвергаются диссоциации в неденатурирующих детергентах. Поэтому для
колоночной хроматографии принято использовать крупнопористую сефарозу,
агарозу и полиакриламид (см. также гл. 5). В некоторых случаях могут
возникнуть затруднения в связи с агрегацией белков или их необратимой
адсорбцией на хроматографических носителях, но, вообще говоря,
эффективность начальных этапов фракционирования зависит прежде всего от
правильного
Выделение и модификация мембранных белков
257
выбора детергента. Если есть опасения, что может произойти необратимая
адсорбция белка, можно попытаться заменить носитель. Например, носители,
приготовленные на основе полиакриламида, как правило, более инертны. Их
можно использовать как с мягкими, так и с жесткими (т. е.
денатурирующими) детергентами, но следует проявлять осторожность при
работе с органическими растворителями. Для последних требуются
специальные модифицированные носители (см. ниже).
Весьма полезным для фракционирования интегральных мембранных белков может
оказаться и применение хроматографических систем, основанных на принципах
ВЭЖХ и скоростной жидкостной хроматографии белков (СЖХБ), особенно в тех
случаях, когда процесс очистки лимитируется количеством белка и временем
его фракционирования. В настоящее время имеется богатый выбор носителей
для ВЭЖХ и СЖХБ, главным образом на основе силикагеля и синтетических
полимерных материалов (например, гидроксилированных полиэфиров), и их
ассортимент постоянно расширяется. Размер пор выбираемого носителя
определяется диапазоном молекулярных масс разделяемых белков. Фирмы-
поставщики предлагают носители, позволяющие разделять белки с мол. массой
от 500 до 2-107. В присутствии неденатурирующих детергентов эффективность
разделения, как правило, снижается. Большинство имеющихся в продаже
носителей можно использовать в нейтральных органических растворителях,
детергентах и в присутствии денатурирующих агентов, таких, как
гуанидингидрохлорид и ДСН. По нашим данным, сорбенты типа TSK. (например,
Ultrapac SW фирмы LKB) вполне годятся для белков, солюбилизированных в
ДСН.
Особенно осторожным следует быть, когда разделение проводится при
экстремальных значениях pH. Этому есть две причины. Во-первых, в очень
кислых условиях, часто применяемых при разделении в сочетании с
органическими растворителями, ускоряется разрушение носителей,
приготовленных на основе силикагеля. (Еще более разрушительными являются
щелочные условия при рН>8.) В результате удаления с носителя защитных
групп усиливается необратимая адсорбция на нем полипептидов. Во-вторых,
существует опасность повреждения тех элементов аппаратуры для ВЭЖХ,
которые сделаны из нержавеющей стали, поскольку в используемых смесях
растворителей содержится агрессивная муравьиная кислота. Некоторые
изготовители этой аппаратуры утверждают, что они используют
