Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
в ее внутреннем объеме.
3.2.3. Хроматофокусироаание
Пожалуй, наиболее перспективным методом очистки интегральных мембранных
белков является хроматофокусированне [40, 411, которое больше подходит
для препаративных, чем для аналитических целей. Этот метод сходен с
изоэлектрическим фокусированием, отличаясь от последнего тем, что
градиент pH формируется не в буфере, а на неподвижном наполнителе
колонки. Эти наполнители устойчнзы в диапазоне pH от 3 до 12,
262
Глава 6
но обычно лучше всего работают в интервале pH 5-9. Их можно использовать
в сочетании с нейтральными органическими растворителями, с
денатурирующими агентами (такими, как 8 М мочевина и 6 М
гуанидингидрохлорид), а также с детергентами- как незаряженными
(например, дигитонин, тритон Х-100), так и цвиттерионными (CHAPS). Метод
является быстрым, эффективным и сравнительно недорогим. Полибуфер-ный
носитель можно удалять так же, как описано выше для амфолитов. По
запросам фирма Pharmacia может выслать информационную брошюру с описанием
теоретических и практических аспектов этого многообещающего метода.
3.3. Гидрофобная хроматография
В настоящее время все более широкое применение находит также гидрофобная
хроматография, при которой белки и пептиды связываются с гидрофобными
группами, ковалентно пришитыми к носителю. Адсорбция белков на носителе,
например на октил- или фенилсефарозе или на суперозе, происходит за счет
гидрофобных взаимодействий и усиливается при высоких концентрациях солей
(например, в 50-80%-ном сульфате аммония), при низких pH и при высоких
температурах. Белок затем элюируют солевыми растворами с уменьшающейся
концентрацией. Чтобы улучшить разделение и повысить выход белка с
колонки, в элюирующий буфер можно включить этиленгликоль, метанол или
этанол. Такой же результат дает повышение pH и понижение температуры.
Следует, однако, указать на ограниченную применимость этого подхода для
большей части интегральных мембранных белков. Во-первых, эффективность
модифицированного носителя резко снижается в присутствии детергента (и
еще сильнее в присутствии органических растворителей). Во-вторых,
разделение интегральных мембранных белков скорее всего будет
неудовлетворительным. В некоторых случаях этот метод может оказаться
полезным для отделения интегральных белков от периферических.
3.3.1. Хроматография с обращенной фазой
Это особый вид гидрофобной хроматографии, наиболее близкой к ВЭЖХ и СЖХБ.
К макропористому носителю (с диаметром пор 250 А и выше) химически
пришивают цианпропиль-ные или (ди) фенильные остатки либо чаще всего н-
алкильные цепи, содержащие от 2 до 18 СН2-групп. Как правило, чем крупнее
й гидрофобнее белок или пептид, тем короче должна быть углеводородная
цепь на носителе (цепь С4 особенно эффективна для крупных пептидов, а
цепь С18 - для малых).
Выделение и модификация мембранных белков
263
Чтобы продлить срок использования носителя и уменьшить вероятность
возникновения артефактов, следует выбирать такие носители, которые были
подвергнуты защитной модификации, т. е. блокированию силанольных
остатков, не содержащих цепей С4-С18, с помощью низкомолекулярных
разветвленных си-ланов.
Большое значение имеет выбор растворителя (подвижной фазы), хотя следует
отметить, что до сих пор предложено лишь ограниченное число систем.
Вследствие нестабильности силика-гелевых носителей растворители с
щелочными pH использовать не следует, в то же время при нейтральных pH
часто происходит уширение пиков и ухудшается разделение. Это объясняется
взаимодействием аминогрупп пептида с силанольными остатками носителя. В
кислых условиях силанольные группы протоно-ированы и поэтому преобладают
гидрофобные взаимодействия. При разделении обычной смеси пептидов
элюирование, как правило, начинают с 0,01-0,1%-ной трифторуксусной (ТФУ)
или пентафтормасляной кислоты. Вместо них можно использовать фосфорную
или хлорную кислоту в концентрации до 0,1%, чтобы повысить гидрофильность
пептидов, но при разделении гидрофобных пептидов эти добавки применяют
редко. Может оказаться полезным включение в водные системы органических
аминов, например фосфата триэтиламина (0,1%), благодаря чему ослабляются
ионные взаимодействия между носителем и пептидом. Добавление в небольшом
количестве органических растворителей может повысить растворимость
пептидов.
Образцы следует наносить на колонку в небольшом объеме (около 100 мкл)
водного растворителя. Для растворения сильно гидрофобных белков и
пептидов может понадобиться использовать 90%-ную муравьиную кислоту. Хотя
эти условия неблагоприятны для носителя, их все же можно применять для
нанесения образца на колонку. По мере разбавления муравьиной кислоты
пептиды адсорбируются (или осаждаются?) на носителе. Затем их элюируют
системами с возрастающим градиентом органического растворителя, т. е.
системами с уменьшающейся полярностью. Полезно помнить следующий ряд
полярности: вода>метанол>этанол>ацетонитрил> 1-пропанол>
