Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
высококачественную нержавеющую сталь, которая устойчива к этим
воздействиям; другие предпочитают изготавливать смесительные камеры с
керамическим или титановым покрытием.
К счастью, здесь есть возможность альтернативных подхо-
17-1468
258
Глава 6
дов. Если белок имеется в достаточном количестве, то его очистку можно
проводить на гидроксипропилированных декстранах (сефадексы LH-60 и LH-
20), используя почти все мыслимые смеси органических растворителей и
кислот. В этом отношении полезны система растворителей FACE и смесь
муравьиной кислоты с этанолом, особенно первая, поскольку она обычно
позволяет хроматографическн удалять все детергенты и липиды, переводя их
в низкомолекулярную мономерную форму. Помните, что все детали
хроматографической аппаратуры, контактирующие с этими системами
органических растворителей, должны быть изготовлены из стекла и тефлона.
Отдельные белки и многие пептиды растворяются (некоторые в виде
агрегатов) в муравьиной кислоте, концентрация которой может достигать 90%
(о/о). В таких экстремальных условиях можно использовать носители типа
сефадекса и полиакриламида для фракционирования компонентов смеси по
размеру. Однако подобные условия разрушительно действуют как на носитель,
так и на пептид, поэтому хроматографию следует проводить при низких
температурах н высоких скоростях элюирования. Само собой разумеется, что
носители нельзя хранить в этих растворителях.
При использовании агрессивных органических растворителей полезной может
оказаться также система СЖХБ фирмы Pharmacia. Основные детали этой
аппаратуры изготовлены главным образом из тефлона и стекла и поэтому
менее подвержены разрушению под действием кислот. Носители на основе
силикагеля, пока используемые в лабораторной практике чаще всего, по-
видимому, более устойчивы к этим растворителям. Недостатком носителей на
основе агарозы (суперозы) является их склонность к необратимой адсорбции
мембранных белков. Эти носители более пригодны для гель-фильтрации, хотя
прн этом приходится прибегать к использованию детергентов. Носители на
основе силикагеля лучше всего подходят для хроматографии с обращенной
фазой (см. ниже). ВЭЖХ- и СЖХБ-анализ осуществляется намного быстрее (за
30-60 мин), чем анализ с использованием обычных стеклянных колонок, и
часто дает лучшее разделение компонентов в соответствии с поставленной
задачей. Однако емкость колонок ограниченна, и может потребоваться
повторить много раз хроматографию идентичных проб исходного образца.
Важно при этом не перегружать колонку и не задавать слишком высокую
скорость элюирования. Для грубой ориентировки можно рекомендовать
следующее правило: нужно наносить не более 1 мг общего белка на 1 мл
упакованного носителя и проводить элюирование не быстрее, чем за 30 мин,
но не дольше 90 мин.
Выделение и модификация мембранных белков
259
3.2. Разделение по заряду
3.2.1. Ионообменная хроматография
Для выделения мембранных белков можно использовать все классические
ионообменные системы, которые применяются для очистки белков, прн
условии, что исходный заряд полипептида не нейтрализуется при добавлении
заряженных детергентов или при его растворении в сильных кислотах или
щелочах. Наиболее популярными пока остаются слабозаряженные ДЭАЭ- и КМ-
иониты (на основе, например, целлюлозы и декстрана), но, если их
используют в присутствии детергента, следует удостовериться, что
последний сам по себе не препятствует взаимодействию белка с адсорбентом.
Эффективность очистки на этих носителях в значительной мере зависит от
природы выделяемого белка. Если белок преимущественно гидрофилен, можно
подобрать условия, при которых он будет прочно связываться с ионитом.
Напротив, белки, которые в значительной степени погружены в бислой и
потому после солюбилизации плотно окутаны детергентной оболочкой, имеют
намного меньшие возможности для взаимодействия с заряженным адсорбентом.
С учетом этого ДЭАЭ-колонки обычно уравновешивают буфером довольно низкой
ионной силы (например, <0,1 М трис-НС1 или фосфатным буфером), содержащим
детергент (порядка 0,1°/о) и, возможно, фосфолипид (0,1%), прн pH 6,5-
8,0. Элюирование проводят солевыми растворами возрастающей концентрации
(например, 0-1 М NaCI или КС1), которые также содержат детергент и/или
фосфолипид [25]. КМ-сорбенты обычно уравновешивают при слабо кислых pH
(5,5-7,0), а для элюирования чаще всего используют растворы с градиентом
pH, а не соли. Описано разделение на ДЭАЭ- [26] и КМ-целлю-лозе [27] с
помощью смесей органических растворителей (например, хлороформ/метанол) с
различным содержанием воды, но в большинстве случаев это скорее
вынужденная мера, а не способ, который можно было бы рекомендовать в
качестве универсального.
Наконец, для ВЭЖХ и СЖХБ получены ионообменные силикагели и синтетические
смолы с различными размерами пор [28-30]. По своей емкости в расчете на
общий белок они по крайней мере в 20-30 раз эффективнее, чем обычные
