Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
носители для гель-фильтрации. Во многих отношениях их можно использовать
так же, как и обычные носители, и им присущи те же достоинства и
недостатки, которые обычно проявляются в стандартных системах ВЭЖХ н
СЖХБ. Еще одним носителем, применение которого оказалось успешным для
исследования мембранных систем [31], является гидроксилапатит. В больших
колонках его использование затруднено: возникают проблемы,
17*
260
Глава 6
связанные со скоростью элюирования и выходом белка; этот носитель более
приемлем в случае ВЭЖХ. Имеется также целый ряд слабых и сильных
ионообменных сорбентов, которые могут оказаться полезными для
фракционирования мембранных белков, но пока еще не нашли достаточно
широкого применения (см. каталоги фирм-поставщиков, например BioRad).
3.2.2. Изоэпектрическое фокусирование
Для мембранных белков в нативном состоянии характерно такое же различие
по изоэлектрическим точкам, как и для водорастворимых белков. Эти
различия можно использовать для эффективной очистки белков методом
изоэлектрического фокусирования. Белки мигрируют под действием
электрического поля в градиенте pH, и, когда данный белок достигает
области, соответствующей его изоэлектрической точке, дальнейшая миграция
прекращается - он как бы "фокусируется". Этим методом можно достичь очень
тонкого разделения компонентов, вплоть до отделения фосфорилированного
белка от его нефос-форилированной формы [32]. Некоторые примеры
применения изоэлектрического фокусирования для разделения мембранных
белков можно найти в недавно опубликованных статьях [33- 36].
В работах [37, 38] и в методических руководствах, публикуемых фирмами -
изготовителями соответствующего оборудования (например, Pharmacia или
LKB), можно найти описание различных способов формирования градиента pH с
помощью амфолитов при использовании ряда стабилизаторов -
полиакриламидных и агарозных гелей или градиента плотности глице-рола,
сахарозы и сорбитола. Там же описаны способы нанесения белка и проведения
электрофореза. Для растворения мембранных белков необходимы детергенты, и
их следует подобрать таким образом, чтобы они не изменяли заряда белка,
не искажали градиента pH и сами не подвергались фокусированию. Обычно это
неионные детергенты, хотя в принципе можно использовать и цвиттерионные
соединения. Как правило, полезно начинать фракционирование с довольно
широкого диапазона pH (3-10), постепенно сужая его до 2 единиц, так чтобы
примерно в середине этого интервала фокусировался изучаемый белок. При
исследовании основных мембранных белков (р1~ ~7) часто бывает полезно
дополнительно проводить электрофорез в формирующемся градиенте pH (метод
NEPHGE), когда образец наносят в кислой зоне геля [39J. В этой системе
градиент pH не достигает полностью равновесного состояния, и потому
положение белка не соответствует точному значению его pi. Разделение
обычно проводят при 0-4СС и продолжают его
Выделение и модификация мембранных белков
261
еще по меньшей мере в течение 25% времени (обычно 1-2 ч), требуемого для
достижения постоянного напряжения. Этот метод можно использовать как для
аналитического, так и для препаративного разделения. В последнем случае
после завершения фокусирования носитель с помощью насоса осторожно, чтобы
избежать перемешивания, перекачивают в коллектор фракций. Эффективность
разделения в значительной мере зависит от наличия чувствительного метода
количественного определения изучаемого белка, от солюбилизирующей
способности детергента по отношению к этому белку и - что особенно важно-
от возможности предотвратить его агрегацию и/или осаждение.
Одна из возможных проблем - особенно серьезная, если предполагается
проводить анализ белка с целью установления его первичной структуры, -
связана с трудностями полного удаления амфолитов. Обычно рекомендуют
осаждать белок добавлением (NH4)2S04 до концентрации, составляющей 80-
100% от насыщающей. Если таким образом не удается осадить белок, его
можно адсорбировать на гидрофобной колонке, например на фенил- или
октилсефарозе; ее берут из расчета 1 мл на 1 мг белка и уравновешивают
(NH^SO^ взятым в концентрации 80-100% от насыщающей. Сорбент затем
промывают 3- 5 объемами буфера, эквивалентными объему колонки, для
удаления амфолита и элюируют белок растворами низкой ионной силы,
например 0,1 М бикарбонатом аммония. К сожалению, в случае интегральных
мембранных белков, находящихся в де-тергентных растворах, ни эти способы,
ни непосредственная гель-фильтрация, ни длительный диализ не дают
достаточно хороших результатов. Если можно не беспокоиться о сохранении
биологической активности белка, полезной может оказаться гель-фильтрация
на сефадексе LH-60, который уравновешивают и затем элюируют смесью
муравьиной кислоты с этанолом или системой FACE (см. выше). Эффективное
удаление амфолитов достигается на колонке объемом 100 мл, при этом белок
(с мол. массой >15 000) выходит в свободном объеме колонки, а амфолиты -
