Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Финдлея Дж.Б. -> "Биологические мембраны" -> 116

Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.

Финдлея Дж.Б., Эванза У.Г. Биологические мембраны — М.: Мир, 1990. — 424 c.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani1990.djvu
Предыдущая << 1 .. 110 111 112 113 114 115 < 116 > 117 118 119 120 121 122 .. 191 >> Следующая

пробирке подходящего размера.
254
Глава 6
4. Нагревают до 25-30 °С за 5 мин и затем центрифугируют в течение
примерно 5 мин при 100 g и температуре выше 20 °С.
5. Фаза детергента образует маслянистый слой на дне пробирки. Водную
фракцию можно снова смешать с 0,5%-ным (в/о) тритоном Х-144, а
детергентную фазу - с водным буфером и повторить процесс.
Эта методика основана на необычных свойствах детергента, который при 0°С
растворим в водном буфере, а выше 20 °С выделяется в виде отдельной фазы.
При этом гидрофильные (т. е. периферические) белки попадают в водную
фазу, а гидрофобные оказываются в детергентной фазе. Как нередко бывает
при использовании детергентов, изучаемый белок может оказаться
нерастворимым, ненативным или неактивным в тритоне Х-114, и это надо
выяснить с самого начала. Если белок нерастворим, его можно выделить,
проведя центрифугирование солю-билизата при 0°С. Интегральные белки с
повышенной гидро-фильностью (например, белки, имеющие один
трансмембранный полипептидный сегмент и/или содержащие значительное
количество ковалентно связанных углеводов) могут оказаться в водной фазе
вследствие самоассоциации или связывания детергента, часть которого
всегда присутствует в водной фазе. Отмечено также, что каналобразующие
белки (например, ацетилхолиновый рецептор, АТРазы) также могут аномально
распределяться в двухфазной системе [10, 11J. Применение этого метода
описано в работе [12].
2.2.2. Удаление липидов
Солюбилизация мембраны детергентом обычно приводит к образованию
смешанных мицелл, содержащих как фосфолипиды, так и детергент.
Большинство интегральных белков (вместе с другими белками или без них)
находятся в солюбилизате в виде комплексов, имеющих мономолекулярную
оболочку из детергента (см. рис. 5.1). Эти комплексы могут удерживать
небольшое остаточное количество фосфолипидов. Часто эти липиды удаляются
при последующей очистке, но в некоторых случаях при особо прочном
связывании липидов для их удаления может потребоваться экстракция
органическими растворителями или денатурация белка с помощью ДСН или
органических растворителей.
1. Органические растворители. Для солюбилизации белков использовали
такие органические растворители, как хлороформ, смесь хлороформа с
метанолом (а также с этанолом или бута-нолом), 1-бутанол, смесь
диэтиловый эфир/этанол (3:1, о/о) [13-16]. Белки, солюбилизирующиеся в
этих условиях, часто ¦относят к классу протеолипидов. Они очень
гидрофобны и обла-
Выделение и модификация мембранных белков
255
дают слабо выраженной амфифильностью; в большинстве мембран такие белки
содержатся лишь в малых количествах. Для примера здесь можно привести
ДЦК-связывающий белок из АТР-синтазного комплекса [17] и протеолипидные
белки миелина. Все они растворимы в смеси хлороформ/метанол (2: 1г о/о)
[13]. При использовании смеси хлороформ/метанол/водный буфер (8:4:3, о/о)
большинство мембранных белков образуют осадок на границе раздела водной и
органической фаз, а все протеолипиды переходят в слой органического
растворителя. В водной фазе обнаруживаются сильно гликолизированные
компоненты мембран, например гликофорин и гликолипиды.Меняя соотношение
хлороформ/метанол, можно до некоторой степени варьировать состав
экстрагируемых белков [18]. Определенные преимущества дает также
экстракция мембран подкисленной, смесью хлороформ/метанол (2:1, о/о),
содержащей до 50 мМ НС1 [19] или 5 мМ л-толуолсульфокислоты [20]. При
этом удается несколько увеличить количество белков, попадающих в
органическую фазу, и изменить их состав.
Экстрагированные белки легко выделить, удалив органический растворитель
на роторном испарителе, а в некоторых случаях их удается осадить, добавив
10-20 объемов холодного-ацетона, 5-10 объемов холодного диэтилового эфира
или смесь диэтилового эфира и этанола различного состава (от 1 : 1 до 3:
1, о/о). Таким же образом выделяют белки из детергентныж растворов. Если
при выделении используются неподкисленные смеси органических
растворителей, то биологическая активность-экстрагированного белка может
сохраниться; иное дело - если используются подкисленные растворители или
белок выделяется осаждением.
Сравнительно недавно предложены две системы растворителей, позволяющие
получать хотя и в денатурированном состоянии, но в растворимой форме
почти все интегральные мембранные белки (а фактически также почти все
водорастворимые белки). Первая из этих систем -смесь муравьиная
кислота/этанол (3:7 или 1:2, о/о)-использовалась для исследования
бактериородопсина [21] и родопсина [22]. Она наиболее пригодна для
белков, не содержащих связанных липидов или детергентов. Вторая система -
муравьиная кислота/уксусная кислота/хлороформ/этанол (1: 1:2:1, о/о) [23,
24]-растворяет большинство мембранных белков; еще одно ее преимущество
состоит в том, что при этом удаляются все фосфолипиды и предотвращаются
агрегация белка и самоассоциация липида. Это значительно облегчает
Предыдущая << 1 .. 110 111 112 113 114 115 < 116 > 117 118 119 120 121 122 .. 191 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed