Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
194
при соответствующих условиях (Boone, 1975; Boone et al., 1979) и утрачивать морфологические и другие критерии трансформации, не теряя туморогенность (Lan et al., 1979).
Как обсуждалось выше, экспрессия раннего вирусного гена(ов), вероятно, вовлечена в инициацию и поддержание трансформированного фенотипа в клетках, трансформированных ДНК-содержащими опухолеродными вирусами. Однако неизвестно» могут ли одни эти гены вызывать опухоли у восприимчивых хозяев. Некоторые данные (Moyer et al., 1979) позволяют предположить, что в определенных системах может потребоваться полный геном, необходимый трансформированным клеткам, чтобы приобрести генетическую информацию от хозяина. Дополнительное сравнимое наблюдение свидетельствует
о том, что полученные с помощью рестриктаз фрагменты ранней области генома SV40 не индуцируют опухоли у хомячков, хотя эти фрагменты трансформируют клетки in vitro (Moyer et al., 1981b, c).
6.5. ИНДУКЦИЯ И «СПАСЕНИЕ» ВИРУСОВ ИЗ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
Потенциальная биологическая активность персистирующего генома опухолеродного вируса лучше всего демонстрировалась спасением инфекционного или трансформирующего вируса из клеточной культуры, поддерживающей вирусный геном. Обработка трансформированных клеток физико-химическими агентами, слияние трансформированных клеток с пермиссивными клетками или трансфекцией ДНК трансформированных клеток в пермиссивные клетки являются обычно наиболее эффективными методами для достижения результатов. Культивирование трансформированных клеток с пермиссивными клетками также проделано для так называемого спасения вируса, однако мы наблюдали пониженную эффективность его в клетках, трансформированных паповавирусами. Различные модификации этих методов в соединении с биохимическими методами, используемые для изучения взаимодействия вирус —- клетка хозяина (Doerfler, 1975, 1977), были предприняты для спасения провирусных геномов и выяснения механизма(ов), с помощью которого оно осуществляется. Биологические методы слияния этих клеток (Watkin,
1975), энуклеированных клеточных компонентов (Pringle, 1977) или трансфекции ДНК (Graham, 1977; Zhdanov, 1977) проанализированы в обзорах.
Множество биохимических (Air, 1979) и электронно-микроскопических (Evenson, 1977) методов было использовано для анализа вирусных геномов дикого, дефектного и спасенного типов. Эти методы включают спасение дикого типа с дефектным и спасенным по отношению к рестрикционной эндонуклеазе вирусом, или другим резанным эндонуклеазой фрагментам, гибридизацию нуклеиновых кислот, картирование гетеродуплекса, R-петли, секвенирование ДНК. С помощью таких методов можно определить локализацию делеции, замещения, инверсии, дополнения и т. д. в вирусных геномах. Замещенные последовательности клетки хозяина^ которые предположи-
14*
195
тельно возникают в результате ошибочного вырезания интегрированной вирусной ДНК, также определяют этими методами (Botchan et al., 1979, 1980). Молекулярный анализ вирусов может быть дополнен оценкой in vitro и in vivo способности вируса реплицироваться в пермиссивных клетках, трансформировать непермиссивиые клетки и вызывать опухоли у животных.
6.5.1. ДНК-co держащие опухолеродные вирусы
Клетки, трансформированные ДНК-содержащими вирусами,; обычно не продуцируют инфекционный вирус, даже если содержат вирусную ДНК, интегрированную в геном хозяина (Tooze, 1973; Doerfler, 1977). Вирусы были спасены из некоторых систем вирус — клетка, однако некоторые попытки спасения были безуспешными. Так как клетки, трансформированные вирусами полиомы мышей и SV40 обезьяны, подвергались наиболее интенсивному изучению, они рассмотрены ниже в деталях.
Аденовирусы не были спасены из трансформированных клеток даже после слияния с пермиссивными клетками (Doerfler, 1977; Tooze, 1973). Хотя большинство экспериментов было относительно кратковременным и пермиссивные клетки могли быть не лучшими, персистирование неполных геномов, или интенсивная фрагментация генома (см. Sutter et al., 1978; см. также Doerfler, 1977г и ссылки на изложенный здесь материал), или метилирование интегрированного генома (Gunthert et al., 1976) могут объяснить негативные результаты спасения аденовирусов. С тех пор как получены продуцирующие и пепродуцирующие линии клеток, трансформированные вирусом герпеса (Heedman, Klein, 1973), были разработаны эксперименты по спасению, которые могут быть предназначены для увеличения репликации вируса в продуцирующих клетках или инициации вирусной репликации в непродуцирующих клетках, в которых индуцибель-ность может варьировать (Bister et al., 1979; Magrath et al., 1979).
Трансформированные вирусом полиомы клетки хомячка обычно не продуцируют инфекционный вирус даже после слияния с пермиссивными мышиными клетками (Doerfler, 1977; Folk, 1973; Prasad et al., 197G; Zouzias et al., 1977). Причины этого неизвестны. Однако линии клеток хомячка, трансформированные определенными термочувствительными по Т-антигену мутантами вируса полиомы, продуцируют инфекционную вирусную ДНК или вирус полиомы вслед за слиянием, когда температура изменяется от непермиссивной к пермиссивиой (Folk, 1973). Это позволяет предположить, что для спасения могут быть необходимыми Т-антигены вируса полиомы. В случае вируса полиомы спасение инфекционного вируса с помощью физической или химической индукции, слияния клеток было наиболее эффективным для трансформированных клеток крысы (см. Fogel, 1975, и ссылки там же; также Prasad et al., 1976; Zouzias et al., 1977). Это вполне вероятно, потому что клетки крысы являются пол-упермиссивными для вируса полиомы, содержат некоторое количество неинтегрированных молекул вирусной ДНК (Prasad et al.x
