Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Растворы сахарозы чаще всего готовят в водных буферах с pH, близким к нейтральному. При высокой концентрации сахароза связывает значительную часть воды, что может привести к агрегации макромолекул любого рода (как при осаждении спиртом или этиленгликолем). В качестве контрмеры прибегают к добавлению диссоциирующих агентов (солей в повышенной концентрации, иногда гуанидинхлорида или мочевины, нередко 0,2— 1% ДДС-Na).
При центрифугировании денатурированной ДНК или однони-тевых РНК бывает необходимо предотвратить их реассоциацию и агрегацию за счет образования случайных водородных связей между основаниями. Для ДНК это осуществляют подщелачива-нием раствора NaOH (до 0,1 М). В случае РНК щелочь непригодна (гидролиз!), но можно создать градиент плотности растворением сахарозы не в воде, а в концентрированных растворах формамида или диметилсульфоксида (ДМСО), иногда даже в 100%-ном формамиде или ДМСО, Полученные градиенты называют «денатурирующими градиентами сахарозы». Следует помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через кожу, поэтому работать необходимо в перчатках. Кроме того, ДМСО разрушает нитроцеллюлоэные и поликарбонатные пробирки. Из него необходимо удалять следы тяжелых металлов перемешиванием в течение 1,5 ч с 3%-ной суспензией бифункциональной ионообменной смолы. Перед нанесением на градиент препараты нуклеиновых кислот целесообразно прогревать в течение 2— 3 мин при 80° для разрушения уже образовавшихся агрегатов.
Технически проще всего осуществить «линейный градиент», в котором концентрация сахарозы (и плотность раствора) линейно увеличивается от мениска ко дну пробирки. Разность между концентрациями раствора у мениска и у дна пробирки, равная 15%, вполне достаточна для предотвращения конвекции. Выбор концентрации начала градиента (на мениске) зависит от плотности наслаиваемого на градиент препарата. Если это водно-со-левой раствор, можно начинать градиент с 5%-ной концентрации сахарозы; часто употребляют градиент 5—20%. Если же наносят клеточный гомогенат в 0,25 М сахарозе (8,3%), то градиент начинают обычно с 15%-ного раствора. Как будет показано ниже, для линейных градиентов сахарозы с диапазоном изменения концентраций в 15% (например, 5—20 или 15—30%) повышение вязкости приблизительно компенсирует, увеличение центробежной силы за счет продвижения частиц вдоль радиуса вращения (длины пробирки).
Если же в состав препарата входят частицы с очень большими значениями константы седиментации и есть необходимость затормозить их оседание при подходе ко дну пробирки, то используют либо более крутые линейные градиенты (с диапазоном 20 или 25%), либо градиенты вогнутой формы. Увеличение крутизны градиента приводит к сужению полос (зон) частиц. Передний край зоны, вступая в область повышенной вязкости и плотности раствора сахарозы, замедляет свое движение по сравнению с задним краем. Однако по той же причине уменьшается и расстояние между зонами, поэтому разрешение (разделение) зон или пиков не очень зависит от крутизны градиента. Если разделяют вещества с близкими значениями s20,w, то берут пологие градиенты плотности, а узость зон стараются обеспечить за счет тонкости начального слоя. Компенсировать при этом уменьшение объема препарата за счет увеличения концентрации вещества в нем можно лишь в определенных пределах. Дело в том, что плотность раствора препарата накладывается на плотность градиента сахарозы. В силу диффузии препарат внутри зоны распределен неравномерно, профиль распределения имеет форму колокола. Если концентрация препарата в зоне невелика, то это наложение не нарушит общего характера нарастания плотности градиента вдоль пробирки. Если же концентрация вещества в зоне значительна, то у переднего ее края образуется локальный участок «обратного градиента плотности», т. е. плотность на этом участке убывает (за счет препарата) в направлении от мениска к дну пробирки. Это приводит к конвекции жидкости и размыванию зоны. Ясно, что чем круче градиент плотности сахарозы, тем меньше скажется на нем вклад плотности препарата. Именно поэтому для пологих градиентов сахарозы следует опасаться «перегрузки» зон при увеличении концентрации препарата в исходном слое. Довольно часто плохое разрешение зон при зональ-
но-скороСтном центрифугировании в градиентах сахарозы бывает
обусловлено именно этой причиной.
Для белков и нуклеиновых кислот и градиентов обычной крутизны исходная концентрация вещества в препарате не должна превышать значений порядка 1 мг/мл.
СОЗДАНИЕ ГРАДИЕНТА ПЛОТНОСТИ САХАРОЗЫ
Простейшее устройство для создания линейного градиента сахарозы (рис. 51) представляет собой два цилиндрических сосуда одинакового диаметра, соединенные у дна каналом с краном или зажимом. Один из цилиндров имеет еще и выводную трубку малого диаметра, через которую жидкость подается в центрифужную пробирку. В этом же цилиндре должна находиться мешалка, обеспечивающая смешивание каждой порции жидкости, поступающей из сосуда 1 (резервуара), со всем объемом жидкости в сосуде 2 (смесителе). Цилиндры могут быть стеклянными, соединенными между собой мягкой трубкой с зажимом, или высверленными вместе с каналами в блоке плексигласа.
