Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 95

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 89 90 91 92 93 94 < 95 > 96 97 98 99 100 101 .. 130 >> Следующая

ентов плотности (как линейных, так и экспоненциальных) .описаны ниже. j
Однако, как будет видно из приведенных ниже графикой, простые линейные градиенты плотности сахарозы в диапазонах 5— 20% и 15—30% и для этих роторов дают не слишком большие отклонения скорости оседания частиц от постоянных значений. В первом приближении их можно считать изокинетическими и использовать для расчетов по указанному выше простому способу. Серьезность вносимой таким упрощением ошибки следует сопоставлять с сохранностью положения зон при «раскапывании» градиента, точностью измерения объемов и шириной зон.
Еще лучше использовать два маркера, один из которых оседает быстрее, а другой — медленнее, чем интересующая исследователя зона. Константу седиментации для этой зоны можно рассчитывать по известным константам седиментации маркеров и относительному расположению пика зоны препарата между пиками маркеров путем линейной интерполяции.
В качестве маркеров для РНК удобно использовать рибосом-ные РНК с константами седиментации 16S и 23S (бактериальные), 5S, 18S и 28S (из рибосом животных), а также транспортные РНК (s2o,w=4S). Маркерами для ДНК часто служат двуни-тевые фаговые ДНК определенной структуры. Ниже приведены характеристики некоторых из них:
Источник маркера Структура Д 4К S20,w*s
ФХ174 Кольцевая 16,0
ФХ174 », сверхскрученная 20,7
ФХ174 », однонитевая 22,7
Аденовирус 12 Линейная 30,7
Фаг X 36,2
» Кольцевая 40,9
Фаг Т5 Линейная 48,5
Фаг Т2 » 65,0
Практически удается разделить и охарактеризовать с пог мощью зонально-скоростного центрифугирования частицы, отличающиеся между собой по значению s20,w не менее чем на 10%.
ВЫБОР СРЕДЫ
Для создания градиентов плотности среды при зонально-скоростном центрифугировании нашли применение растворы следующих веществ: сахарозы, глицерина, метризамида («Metrisami-de»), фиколла («Ficolb) и перколла («Percoll»). Первые два вещества общеизвестны, поэтому приведем краткие характеристики трех остальных.
Метризамид — фирменное название довольно сложного производного трийодбензойной кислоты. К бензольному кольцу, кроме трех атомов йода, присоединены еще ацетамид и N-метил1
?*цЦамид.
нон. с
н
—а !
•Метризамид
Карбоксильная группа бензойной кислоты блокирована амидной связью с 2-амино-З-дезоксиглюкозой. Молекулярная масса метризамида — 789. Наличие трех атомов йода обеспечивает высокую собственную плотность этого вещества (2,17 r/см*). Остаток глюкозы и три карбонильных кислорода обусловливают очень хорошую растворимость в воде. Метризамид хорошо растворяется и в метаноле, этаноле, диметилформамиде и диметил-сульфоксиде. Вместе с тем ионогенные группы отсутствуют — 'молекула не несет заряда; лишь при pH 10 проявляются слабо-кислые свойства.
Метризамид химически инертен и устойчив в диапазоне ¦ pH 2,5 —12. С биополимерами он не взаимодействует, даже практически не влияет на степень их гидратации в растворе (не отнимает воду). Метризамид не осаждается кислотой и 70%-ным этанолом — белки и нуклеиновые кислоты легко осадить из его -раствора.
; К недостаткам метризамида относятся следующие. Ультрафиолетовое облучение его (и даже дневной свет), а также нагревание выше 55° ведут к частичному освобождению йода. Растворы метризамида нельзя автоклавировать: их стерилизуют фильтрованием. Метризамид сильно поглощает в ультрафиолетовой .области спектра (ЯМ(ШС=242 нм), в том числе при 260 и 280 нм, но ^не мешает окраске биополимеров, например нуклеиновых кислот, -бромистым этидием. Для сцинтилляторов на основе дноксана и -нафталина метризамид является очень сильным тушителем, а 'для тритон-толуольных — умеренным (падение эффективности •счета до 20%) • Определение РНК с орцином, ДНК с дифениламином и белка по методу Лоури нельзя проводить в присутствии метризамида — его следует удалить ультрафильтрацией,
Метризамид довольно слабо окрашивается обычным красителем для белков — СВВ. Если разбавить фракцию после центрифугирования до концентрации метризамида менее 4% и такой же раствор метризамида использовать в кювете сравнения,
то содержание белка во фракции можно определять по связыванию с ним красителя [Gogstad, 1980].
Твердый метризамид в виде белого порошка можно хранить как угодно долго при комнатной температуре, если он защищен от света. Растворы его могут быть атакованы микроорганизмами. Метризамид выпускает норвежская фирма «Nyegaard».
Фиколл-400 — полисахарид, полученный сополимеризацией сахарозы и эпихлоргидрина, с молекулярной массой 400000, хорошо растворимый в воде и устойчивый в широком диапазоне pH (при рН<3 гидролизуется). Следует избегать его контакта с сильными восстановителями и окислителями. По плотности растворы фиколла уступают растворам сахарозы той же концентрации, а по вязкости заметно их превосходят. Главным достоинством фиколла является малое (при концентрации ниже 20%) осмотическое давление его растворов. Большой размер молекул фиколла не позволяет им проходить через клеточные мембраны, поэтому его используют для создания градиентов плотности при центрифугировании клеток, клеточных органелл и частиц, связанных с мембранами. Эти градиенты применяют не только при зонально-скоростном, но и (чаще) при равновесном центрифугировании [Aspray et al., 1975]. Порошкообразный фиколл производит шведская фирма «Pharmacia».
Предыдущая << 1 .. 89 90 91 92 93 94 < 95 > 96 97 98 99 100 101 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed