Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
^20, W
Для определения константы седиментации не обязательно проводить центрифугирование в воде. Можно воспользоваться результатами центрифугирования в любой среде, если известны ее характеристики (рс и т)с) и удается определить коэффициент седиментации 5. Формула перехода от коэффициента седимента-
ции частицы (в данном опыте) к ее константе седиментации получается при делении выражения для si0|W на выражение для s; при этом k' и Dг сокращаются:
__ „ (Р Pao.w) Пс
^ao,w — 5 - — ,
^20, W (Р Рс)
Удобнее вместо величины s вновь ввести те экспериментальные параметры, которые служат для ее определения:
__ V (р Pjo,w) Лс
Sao.w---: : “ •
^W^P-Pc)
Таким образом, можно найти константу седиментации частицы (s20iW), если определить скорость ее оседания (у) в момент, когда она находится на расстоянии г от оси ротора, вращающегося с угловой скоростью При этом должны быть известны плавучая плотность частицы р, а также плотность и вязкость среды (рс, т)с) в той самой точке, где находится частица. Значения плотности и вязкости воды при 20° (p2o,w и Tbo.w) имеются в справочнике. Размерности для v, © и г — соответственно см/с, рад/с и см. Вторая дробь в выражении для s2(l>w дает безразмерный множитель, поэтому получаемая размерность s20,w — секунды.
Скорость оседания частицы очень мала; а угловая скорость вращения ротора велика. Это приводит к столь малым абсолютным значениям s80,w, что для выражения константы седиментации условились ввести специальную величину — сведберг (в честь шведского исследователя), обозначаемую «S», причем 1S = = 10-1* с. Когда говорят, что константа седиментации рибосом животных равна 80S, это означает, что s20 w=80-10-** с.
v
ИЗОКИНЕТИЧЕСКИИ ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ
Как же рассчитать константу седиментации, используя результаты эксперимента? Эта задача очень упрощается, если профиль градиента плотности таков, что увеличение радиуса компенсируется изменениями плотности и вязкости среды вдоль него, и все частицы движутся с постоянными скоростями, которые определяются только их размерами. Градиенты, отличающиеся такой особенностью, называют «изокинетическими». Подчеркнем, что изокинетичность градиента определяется геометрией ротора и распределением концентрации (например, сахарозы) вдоль пробирки.
Она не зависит ни от размеров частиц (следовательно, и от скорости их оседания), ни от скорости вращения ротора.
Так как константа седиментации любой частицы — величина постоянная, то при условии постоянства скорости оседания из основной формулы для Sao.w следует неизменность вдоль изокине-
тического градиента следующего выражения: О 1 (P-Pao.wK r Vw (Р-Рс)
Разумеется, величина со2 также не зависит от положения частицы в пробирке. Таким образом, скорость оседания частицы в изокинетическом градиенте и ее константа седиментации связаны простой зависимостью: s20,w= (p/a2) V. Для двух частиц, имеющих разные константы седиментации — s80iWl и sго,„8, но одинаковые плотности (р входит в состав {5) и оседающих в одной и той же пробирке, отношение скоростей оседания в данном опыте будет равно отношению их констант седиментации:
Sz0,wJS20,w2 = Vt/VZ-
Но при постоянстве скорости движения путь, пройденный частицей, равен произведению ее скорости на время центрифугирования. Поэтому если расстояние двух частиц (практически зон) от мениска жидкости к моменту окончания центрифугирования обозначить U и /2, то будет справедливо соотношение:
®20,W| /$20, w2 = IJll-
Это соотношение подсказывает простой способ определения константы седиментации исследуемых молекул путем сопоставления их с «маркером» — веществом такой же природы (белок, ДНК или РНК), но с известным значением s20,w. Оба эти вещества надо, предварительно смешав, разделить зонально-скоростным центрифугированием в изокинетическом градиенте плотности, а затем по соотношению расстояний, пройденных их зонами от мениска, рассчитать искомую величину: s2o,w = S2o,«m (УЬ)- Буквой «м» обозначен маркерный препарат. Для цилиндрической части пробирки отношение расстояний от мениска можно заменить отношением соответствующих им объемов. Опорожнять пробирку в этом случае удобнее, начиная с мениска (см. ниже). Объемы нередко заменяют числом капель. При этом следует проявлять осторожность, так как объем падающей в коллектор капли зависит от поверхностного натяжения и плотности жидкости, а они неодинаковы на разных участках градиента плотности.
Практически изокинетическим оказывается линейный градиент концентрации сахарозы от 5 до 20% для бакет-ротора SW 50.1 (он аналогичен ротору SW 39, снятому с производства). Та же картина для этого ротора наблюдается и при градиенте от 15 до 30% сахарозы.
В бакет-роторах новой конструкции с удлиненными пробирками действительно изокинетическими оказываются только гра-диенты с экспоненциальным профилем. Расчеты параметров таких градиентов опубликованы в виде соответствующих таблиц [McCarty et al., 1974]. Способы образования в пробирках гради-
