Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Недавно предложено очень простое устройство для отсасывания градиента в направлении от мениска ко дну через плаваю*
Шую нейлоновую .пробку с трубочкой в середине fOlenick, Lorenz, 1979]. Надежной апробации оно еще не прошло.
Обнаружение полос (зон, пиков) в случае достаточной концентрации в них белков или нуклеиновых кислот нередко ведут по поглощейию света в ультрафиолетовой области спектра. Для частиц иногда удается регистрировать мутность в диапазоне длин волн 500—600 нм. Желательно, чтобы трубки, идущие от пробирки с градиентом к проточной кювете денситометра и, далее, к коллектору фракций, во избежание смешивания градиента в них были по возможности короткими и тонкими. Объем проточной кюветы также должен быть небольшим. Движение жидкости по кювете и трубкам должно происходить снизу вверх — опять-таки во избежание образования участков «обратного градиента», где более плотная жидкость окажется над менее плотной. Разумеется, это справедливо для тех случаев, когда фракционирование градиента начинают от мениска. В случае отсасывания со дна пробирки, наоборот, жидкость в трубках и кювете должна течь сверху вниз.
Для определения радиоактивности вносят аликвоты из каждой фракции прямо в сцинтиллятор или подсушивают их предварительно на фильтрах. В том случае, когда из-за малой радиоактивности в сцинтиллятор приходится вносить значительный объем, следует иметь в виду, что в тритон-толуольных сцинтилляторах сахароза может выпадать в осадок или образовывать двухфазную систему со значительным тушением. В этом случае лучше использовать смесь Брэя на основе диоксана и нафталина.
Детектирование с помощью определенной химической или ферментативной реакции может потребовать удаления среды, в которой проводилось центрифугирование. Сахароза при высокой концентрации, например, ингибирует активность многих ферментов. Удалить ее можно диализом или гель-фильтрацией.
При препаративном фракционировании ДНК зонально-скоростным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы можно для подбора режима воспользоваться предварительной окраской ДНК бромистым этидием. Центрифугирование затем можно прервать и наблюдать положение зон ДНК в пробирке, освещая ее ультрафиолетовым светом (336 нм). После отделения зон бромистый этидий экстрагируют бутанолом [Raafat-El-Ge-wely, Helling, 1980].
Определение плотности во фракциях сахарозного градиента (для водных растворов) можно производить путем измерения коэффициента преломления, пользуясь для расчетов следующей зависимостью: р0=2,7329 п20—2,6425. В этой формуле коэффициент преломления п20 измеряют при 20°, а плотность раствора сахарозы рассчитывают для температуры 0°. Расчет плотности может оказаться необходимым для проверки линейности градиента или для определения плавучей плотности частиц.
Выше было приведено выражение для константы седиментации частицы. Запишем его еще раз, введя в правую часть множитель 101*, чтобы величину - выразить в единицах Сведберга (S):
s90 w = — Pao,w) ^ Ю18.
^мДР-Рс)
Здесь v — скорость оседания частицы, см/с; © — угловая скорость вращения, рад/с; г — расстояние частицы от оси вращения (см. рис. 57) ; р — плавучая плотность частицы, г/см8; рс —плот-ность среды, г/см3; ть — вязкость ^-Р
среды, которую можно выра- I
жать, например, в сантипуазах, если в тех же единицах представить вязкость воды при 20г (г|20, *); Р20, w — плотность воды р—
при 20°, г/см*. Проведем некото- р------г------------------*
рые преобразования и упрощения ______Смак.
этого выражения. С достаточной |
степенью точности можно принять, что р20, „= 1 г/см5, а т]2о, *= „ „
= 1 СП. Вместо Г подставим ЭК- Рис б7- Обозначение радиусов вра-
А щения в пробирке бакет-ротора
вивалентное ему выражение
Гмнн (г/г„н). Величину ©* выразим в тысячах оборотов в минуту (N), а скорость оседания v — в сантиметрах в час, для чего в знаменатель введем множитель 3600. Подставив все это в формулу для «го,w и преобразовав ее, найдем уравнение скорости оседания частицы:
о = 4- 10-*Ьо,ш№гит Г Г-{9 - ]
Выражение в квадратных скобках (обозначим его а) — безразмерная величина, так как в числителе дроби подразумевается еще и rizo.w^l сП. Для частиц с известной плотностью (р), выбранного линейного градиента концентрации сахарозы и определенного ротора (для которого известны ги„ и r„.„) значение а в любой точке градиента легко рассчитать с помощью табл. 1, в которой даны значения плотности и вязкости растворов сахарозы. Если разбить всю длину градиента от гн„ до 0 на равные участки и подсчитать а для- промежуточных точек, можно построить график изменения скорости оседания частиц данного типа при центрифугировании в данных условиях вдоль всего градиента.
Для выбора условий центрифугирования путем приближенного расчета можно построить номограммы, применимые для решения большинства практических задач такого рода. Разнообразие возможных вариантов эксперимента следует ограничить разумным набором стандартных условий. Например, для сахарозы можно ограничиться следующими диапазонами концентрации (в %): 5—20, 5—30, 10—25, 10—35, 15—30 и 15—40. Три из них
