Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 101

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 95 96 97 98 99 100 < 101 > 102 103 104 105 106 107 .. 130 >> Следующая

Тонкостенная пробирка должна быть перед центрифугированием заполнена почти доверху (нужно лишь оставить свободными примерно 3 мм от края для захвата ее пинцетом). Если объем градиента мал, то поверх препарата с указанными предосторожностями наслаивают парафиновое масло (р=0,89 г/см*). Толстостенные пробирки можно заполнять не до конца, но при этом нагрузка на их стенки (в силу неидеальной цилиндрично-сти) оказывается столь велика, что срок службы сокращается, и никогда нельзя заранее предсказать, когда пробирка может разрушиться. Поэтому надежнее заполнять доверху пробирки и этого типа. В отношении ухода за пробирками, способов стерилизации и постоянного наблюдения за деформацией или появлением трещин остаются в силе все рекомендации, изложенные выше для пробирок угловых роторов.
Перед установкой пробирки в бакет надо обязательно удостовериться в том, что она сухая снаружи и в бакете нет влаги. В противном случае, как уже указывалось, может произойти «прилипание» пробирки к стенке бакета. Если это все-таки произошло, не следует вытаскивать пробирку силой — это повлечет за собой смешивание градиента. Лучше провести «фракциони-
рование» градиента одним из описанных ниже способов, не вынимая пробирки из бакета. Надо следить также за чистотой посадочного гнезда самого ротора и конца вала электродвигателя в камере центрифуги. Ротор должен выниматься из камеры легко, без рывка, который может привести к нарушению градиентов в пробирках.
Следует внимательно следить за температурой. Нежелательно допускать изменения температуры градиента после его формирования. Все растворы, смеситель градиента, бакеты и сам ротор следует выдерживать при температуре центрифугирования перед созданием градиента и установкой пробирок на место. Если это неудобно, то, по крайней мере, после формирования градиента надо дать ему уравновеситься (одновременно с ротором) при температуре центрифугирования в течение не менее чем трех часов, а потом уже наслаивать препарат, выдержанный при той же температуре.
В самом начале центрифугирования следует задать центрифуге минимальное ускорение (см. главу 2). Именно в процессе набора скорости чаще всего происходит смешивание слоя препарата с верхней частью градиента, в результате чего существенно ухудшается разделение зон. Останавливать центрифугу при фракционировании в градиенте плотности следует без торможения. Рабочую скорость центрифугирования, как правило, выбирают максимально допустимой для данного ротора с учетом плотности раствора. Для сахарозы это в большинстве случаев несущественно: ее плотность достигает значения 1,2 г/см3 лишь при концентрации 45%. Работа на максимальной скорости позволяет уменьшить продолжительность центрифугирования и расширение зон за счет диффузии.
Фракционирование («раскапывание») градиента
В препаративных опытах, когда зоны хорошо видны (например, рибосомы — по мутности), можно сверху пастеровской пипеткой с загнутым под прямым углом кончиком отсасывать «пустые» слои раствора сахарозы и — одну за другой — разделившиеся зоны. Другой, также достаточно грубый способ состоит в прокалывании пробирки иглой шприца сбоку, непосредственно под зоной, и отсасывании ее.
Для аналитических целей это непригодно. Вначале широко практиковалось «раскапывание» градиентов при помощи иглы, которой протыкали дно тонкостенной пробирки. Этот простой способ имеет ряд недостатков. Во-первых, при свободном падении капель из иглы их размер меняется по мере изменения плотности вдоль градиента и отсчет равного числа капель не обеспечивает равенства объемов фракций. Между тем это существенно для определения положения зон и расчета констант седиментации. Можно, разумеется, между иглой и коллектором фракций поставить перистальтический насос и тем обеспечить постоянство
Рис. 56. Устройство для фракционирования градиента плотности методом вытеснения
скорости вытекания жидкости из пробирки, но в самом насосе неизбежно некоторое перемешивание градиента. Во-вторых, характер течения жидкости у дна пробирки к скошенному кончику иглы не может быть симметричным, что приводит к некоторому размыванию зон. Наконец, есть опасность попадания осадка со дна пробирки в первые фракции градиента и засорения им иглы.
Второй распространенный вариант — отсасывание градиента со дна через опущенную сверху иглу с ровно обрезанным концом— тоже не очень хорош: градиент, как и в предыдущем случае, проходит через насос. Кроме того, внутри иглы он движется в «обратном направлении» — более плотные слои оказываются выше, чем менее плотные, что приводит к их некоторому перемешиванию.
Лучше всего вытеснять градиент вверх, подавая более плотную жидкость через иглу на дно пробирки. Для сбора градиента на пробирку надевают кониче-ческий колпачок, заканчивающийся трубкой (рис. 56). В качестве вытесняющей жидкости можно использовать 55—60%-ную сахарозу, однако концентрированные растворы сахарозы очень вязки, что создает некоторые трудности. Норвежская фирма «Nyegaard» разработала и выпускает под торговым названием «Maxidens» специальную жидкость, обладающую рядом ценных свойств. По плотности (1,9 г/см$) она не только превосходит любой раствор сахарозы, но и сравнима с насыщенным раствором CsCl (см. ниже). В то же время вязкость ее — такая же, как у воды. «Maxidens» не смешивается с водными растворами и совершенно инертна по отношению к биологическим материалам, неводным растворителям, иногда используемым для создания градиентов плотности сахарозы, а также к материалам пробирок. Ее можно использовать многократно, а в случае загрязнения промывать водой, с которой она затем легко расслаивается. При комнатной температуре «Maxidens» хранится сколь угодно долго. Вытесняющую жидкость можно подавать насосом с постоянной скоростью, а фракции в коллектор отбирать по времени. Ввиду некоторой пульсации тока жидкости от перистальтического насоса лучше воспользоваться шприцем с механической подачей от электродвигателя. Можно подавать вытесняющую жидкость и из бюретки порциями, равными выбранному объему фракций.
Предыдущая << 1 .. 95 96 97 98 99 100 < 101 > 102 103 104 105 106 107 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed