Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Фиколл используют также в смеси с метризоатом натрия, который отличается от метризамида отсутствием замещения по карбоксилу трийодбензойной кислоты. Эта смесь с плотностью 1,077 г/см3, малой вязкостью и малым осмотическим давлением служит для очистки лимфоцитов крови за один цикл центрифугирования. Фирма «Pharmacia» выпускает такую смесь под названием «Ficoll-Paque», фирма «Nyegaard»— «Lympho-prep.».
Перколл представляет собой коллоидные частицы SiO* размером около 17 мкм, покрытые поливинилпирролидоном и поэтому совершенно инертные. Суспензии перколла той же концентрации, что и других перечисленных веществ, имеют наибольшую плотность. Вязкость этих суспензий в воде велика, но резко снижается при добавлении NaCl до 0,15 М. Суспензии перколла .можно автоклавировать.
Благодаря относительно крупным размерам частицы перколла в ходе центрифугирования сами достаточно быстро оседают, образуя градиент плотности по высоте пробирки. Эту плотность можно определять не по коэффициенту преломления (не истинный раствор!), а лишь пикнометрически. Недавно фирма «Pharmacia» начала выпуск специальных порошков с точно известной плотностью. Десять типов таких порошков, различающихся окраской, могут быть использованы для калибровки градиентов плотности перколла. Фирменное название этих порошков—«Density Marker Beads».
Перколл применяют лишь для очистки клеток и достаточно крупных клеточных органелл, осуществляемой обычно в режиме равновесного центрифугирования.
Рис. 50. Плотность (р) и вязкость (rj) водных растворов перколла (/), метри-замида (2), сахарозы (<?), фиколла (4) и глицерина (5) в зависимости от их концентрации
Хотя фиколл и перколл не используют для фракционирования белков и нуклеиновых кислот, интересно сопоставить плотность (р) и вязкость (т]) растворов всех пяти названных веществ в зависимости от концентрации (рис. 50). Следует обратить внимание на то, что концентрации выражены отношением массы растворенного вещества к объему раствора (m/V) *. Значения р и т) даны для 20°.
Из рассмотрения графиков можно сделать ряд выводов.
1. Фиколл и перколл явно непригодны для зонально-скоростного центрифугирования белков и нуклеиновых кислот. При тех концентрациях, которые необходимы для обеспечения устойчивости градиента плотности, вязкость их растворов слишком высока.
2. Вязкость и плотность растворов глицерина, особенно в области высоких концентраций, нарастают медленнее, чем растворов сахарозы и метризамида, но таким образом, что для растворов глицерина и сахарозы с одинаковой плотностью вязкость оказывается значительно выше у глицерина. Поэтому центрифугирование в градиенте плотности глицерина используют главным образом в тех случаях, когда это диктуется какими-либо дополнительными соображениями, например стабилизирующим действием глицерина на активность некоторых ферментов.
3. Метризамид имеет определенные преимущества перед сахарозой в отношении плотности и вязкости его растворов. При одинаковой концентрации вязкость раствора метризамида несколько меньше, чем раствора сахарозы, а плотность — существенно выше. Это означает, что для создания устойчивых градиентов плотности растворов метризамида требуются заметно меньшие его концентрации. И все же метризамид практически почти не используют для зонально-скоростного центрифугирования, что объясняется рядом причин. Одна из них, как будет видно ниже,— очень низкие значения плавучих плотностей нуклеиновых кислот в его растворах и, следовательно, малые скорости осаждения
1 В английской литературе это отношение обозначается w/v.
(разность р—Ре в выражении для о). Правда, это не относится к белкам, но зонально-скоростное центрифугирование преимущественно используют именно для фракционирования нуклеиновых кислот. Второе немаловажное обстоятельство — относительная дороговизна метризамида по сравнению с сахарозой. Наконец, третья причина обусловлена поглощением света в ультрафиолетовой области (проблема обнаружения зон) и тушением сцинтилляции.
Метризамид имеет весьма существенные преимущества при проведении равновесного центрифугирования, поэтому дальнейшее знакомство с его физико-химическими характеристиками и использованием его растворов отложим до соответствующей главы.
Таким образом, почти единственным (во всяком случае, преимущественно употребляемым) материалом для создания градиентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании является сахароза. Остановимся подробнее на свойствах ее растворов, способах образования градиентов плотности, выборе режимов центрифугирования и приведем несколько примеров центрифугирования в градиентах сахарозы.
ХАРАКТЕРИСТИКИ РАСТВОРОВ САХАРОЗЫ
В табл. 1 приведены необходимые экспериментатору значения плотности (р, г/см’) и вязкости (т), сП) растворов сахарозы для двух наиболее часто употребляемых температур—5 и 20°. Концентрация растворов выражена в массовых процентах. Для приготовления соответствующего раствора надо взять навеску сахарозы, численно равную выбранному проценту, и добавить воды
