Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
3. Температура сильно влияет на скорость оседания, прежде всего за счет значительного увеличения вязкости растворов сахарозы при пониженной температуре (см. табл. 1).
4. Чем в более высокой области концентраций сахарозы лежит интервал, тем, естественно, меньше скорость оседания. При переходе от интервалов, начинающихся с 5%, к интервалам, начинающимся с 15%, скорость уменьшается примерно в 1,5 раза.
5. Различия плотности препаратов сказываются слабо й всегда одинаково: •более плотные частицы движутся быстрее. Различия в скорости более заметны к концу градиента.
Подчеркнем еще раз, что все эти выводы относятся к характеру изменений скорости оседания частиц. Абсолютное значение этой скорости определяется константой седиментации и особенно сильно зависит от числа оборотов ротора (N2).
Время, необходимое для достижения частицей определенного положения в пробирке, т. е. определенного значения г, может быть выражено интегралом:
Здесь t выражено в часах, если г—в сантиметрах, а о — в сантиметрах в час.
Располагая кривыми изменения скорости вдоль градиента, можно провести графическое интегрирование. Величины s20,w и N2 не зависят от г и войдут в виде делителей в окончательную формулу, которую, подставляя выражение для v, запишем в еле-
Г
ГЫ№
г
1 Г dr
Величина гмин введена в знаменатель множителя, стоящего перед интегралом, чтобы параметр 2 тоже получился безразмерным. Таким образом, единственный оставшийся параметр «обобщенного ротора» — — вообще не входит в окончательное вы-
ражение для времени центрифугирования t. Физически это означает, что одну и ту же долю длины пробирки частицы проходят за одно и то же время (при прочих равных условиях) в любом бакет-роторе, отвечающем требованию «обобщения» (гманс/гмин = = 2,25). Действительно, чем больше гми„, тем выше начальная скорость оседания, но тем больше и абсолютная длина пробирки, равная 1,25 г„„.
Изменения параметра 2 по длине пробирки «обобщенного ротора» приведены на рабочих номограммах для выбранных ранее градиентов (рис. 59). На оси абсцисс по-прежнему указана доля длины градиента (длины пробирки минус 3 мм, на которые мениск жидкости отстоит от ее верхнего края), обозначенная x/L. Несмотря на ряд допущений, эти номограммы с успехом могут служить для расчета продолжительности центрифугирования, если выбрана скорость вращения ротора (N), примерно известна константа седиментации (s20,w), выбран градиент и задано положение частицы по его длине к моменту окончания центрифугирования. По положению частицы (в долях длины или объема градиента) из соответствующего графика легко найти значение ? и рассчитать t по приведенной выше формуле.
Естественно, что все кривые начинаются от нуля и идут только с нарастанием, которое для градиентов 5—20 и 10—25% практически линейно. Для градиента 15—30% заметно отклонение от линейности из-за некоторого замедления движения частиц вблизи дна пробирки. Для градиентов с интервалом концентраций в 25% нелинейность выражена явно: при приближении ко дну пробирки скорость оседания частиц снижается существенно, особенно для градиента 15—40%.
Как и следовало ожидать, кривые для р = 1,3 г/см3 лежат выше, чем для р = 1,5 г/см3 (менее плотные частицы движутся по градиенту медленнее).
При фракционировании частиц с относительно близкими значениями s20,w следует воспользоваться одним из пологих градиентов с интервалом концентраций в 15%.
Последовательность расчета такова. Выбирают конечное положение на градиенте частиц с наибольшим значением s20,w. Определяют параметр 2 и по нему время центрифугирования t для максимально возможной скорости вращения ротора N. Затем из той же формулы по уже найденным значениям Nat для констан-
10 т.
t - wi>/2 чвсаЗ (N- тыс. об/мин)
Рис. 59. Номограммы для расчета времени центрифугирования (/) в ных градиентах плотности растворов сахарозы (см. текст)
/ - 1,3; 2—1,4; 5- 1,5 г/см3
о
IО
различ'
I
8
4
2
О
Рис. 59 (продолжение)
10-35% сахарозы
/ i
/ /
/>
/ / //
/
/-
г * г
//
rmmf / jr J
// /
/ / V X V / /
t
/у' *
J&W -
ты седиментации наиболее легкой частицы рассчитывают параметр 2 и по нему из графика находят положение этой частицы в пробирке к моменту окончания центрифугирования. Если разрешение покажется недостаточным, можно попытаться сделать градиент еще более пологим (с интервалом в 10%). Для этого случая нет графиков, но можно представить, что скорость движения частицы вдоль градиента будет возрастать почти на всем его протяжении и более тяжелая частица «убежит» от более легкой за время центрифугирования. Однако не надо забывать об уменьшении устойчивости такого градиента в отношении конвекции. Если окажется, наоборот, что различие в константах седиментации фракционируемых частиц столь велико,’что легкие частицы не успеют заметно удалиться от мениска, когда наиболее тяжелые уже приблизятся ко дну, то следует воспользоваться одним из более крутых градиентов (с интервалом в 20 или 25%).
