Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Если в смесителе находится более плотный раствор сахарозы, то плотность вытекающей из смесителя жидкости линейно уменьшается и ее можно постепенно наслаивать в пробирку от дна кверху. Если же в смесителе находится менее плотный раствор, то плотность вытекающей жидкости линейно возрастает и ее можно подавать через длинную иглу от шприца с обрезанным концом все время на дно пробирки. Более плотные слои сахарозы будут вытеснять вверх менее плотный раствор, образуя правильный линейный градиент плотности. Затем иглу осторожно вынимают; градиент при этом не нарушается.
Первый вариант заполнения проще, но непригоден для поли-алломерных и поликарбонатных пробирок, материал которых не смачивается водой. По стенке пробирки вместо непрерывной и слабой струйки жидкости будут сбегать капли, нарушая градиент. Нитроцеллюлозные пробирки смачиваются, но могут не выдержать большой скорости центрифугирования. Смачивание улучшается, если добавить в раствор сахарозы ДДС-Na до
0,01%. Скорость заполнения не должна превышать 1 мл/мин для • пробирок диаметром 25 мм, а для более узких пробирок должна быть соответственно ниже.
Имеется много вариантов фирменных устройств такого рода, однако их легко изготовить и своими средствами. Для каждого типа (объема) пробирок надо иметь отдельное устройство. Для более надежного перемешивания и уменьшения вклада последних порций смеси, когда уровень жидкости в цилиндрах опускается до соединительной трубки, отношение диаметра к высоте цнлинл'ра в момент начала формирования градиента должно составлять 1 : 3 или 1:4.
Даже при создании такого простейшего устройства встают свои -проблемы. Например, магнитная мешалка непригодна: вра-
щающийся на дне сбсуда магнитик либо не будет успевать перемешивать весь объем цилиндра, либо образует воронку, что приведет к изменению соотношения уровней жидкости в двух цилиндрах.
Мешалка в виде платиновой петли с приводом сверху от электродвигателя лучше, но не очень эффективна. Лучше всего перемешивать жидкость винтообразной пластинкой, изготовленной из подогретого плексигласа, таким образом, чтобы при ее вращении от двигателя винт гнал жидкость вверх (как в смесителях фирмы LKB). Но надо учитывать, что ее постоянное по всей высоте цилиндра сечение уменьшает эффективную площадь цилиндра.
Строго говоря, площади — и, следо-зательно, диаметры — двух цилиндров и не должны быть одинаковыми. Одинаковыми должны быть объемы смешиваемых растворов. Однако исходный уровень жидкости более высокой плотности будет ниже, чем уровень менее плотной жидкости, если они заполняют два сообщающихся между собой цилиндра, поэтому площадь основания цилиндра, в который заливается более концентрированный раствор сахарозы, 'должна быть больше площади основания второго цилиндра, заполненного менее концентрированным раствором. Отношение этих площадей должно быть равно отношению плотностей дву? растворов, или, что то же, отношению исходных уровней жидкости в цилиндрах. Можно изготовить цилиндры одинакового диаметра и в тот из них, где находится менее плотная жидкость, вставить стеклянную палочку соответственно подобранного сечения.
Для упрощения иногда идут на изначально неодинаковое заполнение двух цилиндров равного диаметра: менее плотного раствора сахарозы наливают с таким избытком, чтобы при открывании канала между цилиндрами исходные уровни жидкости в них остались без изменения. Тогда жидкость не будет перетекать из одного цилиндра в другой до начала заполнения пробирки. С таким избытком можно примириться, так как цилиндры все равно не могут опорожниться до конца, поэтому суммарный объем жидкости в них должен несколько превышать намеченный объем градиента (что устанавливается эмпирически).
Следует избегать образования воздушного пузыря в соединительном канале. Начинать заливать резервуар следует при открытом кране канала. После заполнения его жидкостью нужно закрыть кран и закончить заливку резервуара. Затем следует наполнить расчетным объемом жидкости смеситель и открыть сое-
Рис. 51. Устройство для создания линейного градиента плотности раствора
I — резервуар; 2 — смеситель
динительный кран. Такая последовательность заполнения обеспечивает немедленное начало формирования градиента при подаче жидкости из смесителя в пробирку.
Выходная трубка, ведущая к пробирке, должна быть короткой и не слишком узкой, чтобы жидкость пошла по ней самотеком, без предварительного ее заполнения. В начале трубки ставят винтовой зажим, позволяющий регулировать скорость вытекания жидкости.
Некоторые фирмы выпускают смесители для' одновременного заполнения трех пробирок с помощью многоканального перистальтического насоса. При этом ввиду практически неизбежного разброса диаметра трубок насоса редко удается добиться одновременного заполнения всех пробирок и, следовательно, одинаковых градиентов. Лучше повторять операцию формирования градиента поочередно, в строго одинаковых условиях.
Если сечения резервуара и смесителя неодинаковы, то градиент будет нелинейным. Выпуклость или вогнутость градиента (по отношению к оси абсцисс) зависит не только от того, какой из цилиндров имеет больший диаметр, но и от того, в каком из них находится более плотный раствор.
