Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Антитела к инсулину; стандартные растворы с известной концентрацией инсулина; конъюгат инсулина с пероксидазой (Иис-ПХ); реагенты для фотометрического или хемилюмииесцеитного определения активности ПХ иа основе о-фенилеидиамииа или люмииола (см. § 1 этой главы); полистирольиые планшеты (оптически прозрачные или непрозрачные в зависимости от способа детекции ПХ); автоматические пипетки; спектрофотометр или люмииометр.
Получение антител
Используется IgG-фракция аитисыворотки морской свинки против иисулииа, выделенная полиэтилеигликолем по описанной ранее методике (с. 277).
Получение конъюгата инсулина
с пероксидазой (Инс-ПХ)
1. Конъюгат Иис-ПХ получают перйодатиым методом (см. гл. 8, § 2). Выделение конъюгата из реакционной смеси осуществляют ионообменной хроматографией на жидкостном хроматографе высокого разрешения (FPLC),
1. В лунки полистирольного планшета вносят раствор IgG-фракции антител в ФБ с концентрацией 5 мкг/мл. Инкубируют 3 ч при' 37°С, затем отмывают лунки ТФБ. Адсорбированные антитела могут храниться до использования при 4°С в течение 6 мес.
2. В первые ряды лунок вносят по 0,2 мл стандартных растворов, содержащих инсулин, в различных концентрациях, а в остальные анализируемые образцы —разведенные в два раза ТФБ. Каждую точку дублируют трижды.
3. Инкубируют при 4°С в течение 12—16 ч, затем тщательно отмывают лункн ТФБ и вносят в них по 0,2 мл раствора конъюгата Иис-ПХ и ТФБ.
4. Инкубируют 15 мин при 37°С (или 1 ч при 4°С), промывают лунки ТФБ и вносят субстратную смесь (см. § 1 этой главы).
5. При проведении спектрофотометрйческой детекции реакцию проводят в течение 20 мин, затем останавливают добавлением 50 мкл 4 М Н»504 и регистрируют оптическую плотность продукта пероксидазиого окисления о-фенилен-диамина при Х=492 нм.
При хемилюминесцентиой детекции активности ПХ в луики планшета вносят по 0,2 мл субстратной смеси на основе люминола и и-йодфеиола. Планшет помещают в кювету люмииометра и регистрируют интенсивность светового излучения в условных единицах.
Интерпретация результатов
1. На основании результатов измерения стандартных растворов строят калибровочный график и определяют по нему концентрацию инсулина в исследуемых образцах.
§ 7. Определение тироксина
Определение тироксина (Т4) необходимо при проведении эндокринологических обследований для оценки функции щитовидной железы, а также для контроля эффективности • терапии ряда заболеваний.
В данном разделе рассмотрен конкурентный метод определения тироксина, основаииый на одновременном связывании определяемого (Т4) и меченного пероксидазой Т4 (Т4-ПХ), адсорбированными иа полистироле специфическими антителами.
Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
Антитела к тироксину; коиъюгат Т4-ПХ; реагенты для спектрометрической (с о-фенилеидиамином) или хемилюминесцентиой детекции ПХ; стандартные сыворотки, содержащие Т4 в известной концентрации (от 0 до 400 нм/л); полистирольные планшеты (прозрачные для спектрофото-метрнческого и непрозрачные для хемилюмииесцеитиого способа определения ПХ; микропипетки; спектрофотометр или люминометр.
Получение антител
В анализе используют у-глобулииовую фракцию антисыворотки кролика к конъюгату Т« с бычьим сывороточным альбумином (БСА), выделенную по стандартной методике.
К раствору N-трифторацильного производного тироксина (40 мг) в 250 мкл диметилформамида добавляют 6 мг N-оксисукцини-мида и 10 мг дициклогексилкарбодиимида в 250 мкл диметилформамида. Реакционную смесь перемеривают при комнатной температуре 1 ч и добавляют порциями по 100 мкл к раствору 20 мп пероксидазы (RZ = 3,1) в 1 мл 0,1 М карбонатного буфера и 0,5 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4°С и затем очищают путем хроматографирования иа колонке с сефадексом G-50 в фосфатном буфере.
Методика проведения анализа
1. В лунки полистирольного планшета вносят раствор Y-глобулииовой фракции антисыворотки в ФБ с концентрацией белка 5 мкг/мл. Инкубируют 12—16 ч при 4°С, аатем удаляют раствор и трижды промывают лунки ТФБ.
2. В первые ряды планшета вносят по 20 мкл стандартных сывороток, содержащих известное количество Т4 и 200 мкл раствора конъюгата Т4-ПХ с концентрацией 50 нг/мл по ПХ. Конъюгат разводят в веронал — медииаловом буфере (см. § 1 этой главы), содержащем 0,2 г БСА и 0,2 г анилинонафталин-сульфокислоты. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, затем тщательно отмывают луики ТФБ.
