Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Методика проведения анализа
1. Адсорбция антител: адсорбционную иммобилизацию антител проводят из раствора с концентрацией 5 мкг/мл в ФБ. В лунки планшета вносят по 0,2 мл раствора. Затем планшеты закрывают крышками и инкубируют в течение ночи при +4°С. На следующий день содержимое лунок сливают1 и планшеты промывают ТФБ 3—4 раза, тщательно встряхивая после последней промывкн. Связанные антитела после высушивания планшетов иа воздухе могут храниться прн —20°С в течение нескольких месяцев без потери способности взаимодействовать с вирусом.
2. Добавление исследуемых образцов. Прн использовании в качестве исходного материала листьев картофеля исследуемый экстракт может быть разведен в 10—50 раз, в случае клубневого материала допускается разведение растительного экстракта в 5—10 раз. Отбор листьев для анализа следует проводить с учетом особенностей локализации вируса в растении в зависимости от фазы развития. Так, например, листовой материал на зараженность Y-внрусом картофеля следует брать из средней н ннжней частей растения. М-внрус картофеля в молодых растениях обнаруживается лучше в нижних листьях, а в зрелых растениях верхние листья содержат больше вируса, чем средине и нижние. В клубиевом материале для определения вирусов наиболее эффективным является экстракт из глазковой части н проростков клубня.
Все анализируемые пробы вносят в лунки планшета в объеме 0,2 мл в ТФБ и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Для каждого тестируемого образца проводят 2—3 параллельных измерения. В качестве контрольных препаратов используют растительные экстракты из здоровых растений; при тестировании очищен-пых препаратов вируса контролем служит препарат гетерологического вируса.
В качестве положительного стандарта используют пул экстрактов листьев (или клубней) здоровых растений, в который добавлен соответствующий вирус в известной концентрации. Эта же биологическая жидкость без добавленного вируса служит отрицательным стандартом.
3. После окончания инкубации с антигеном содержимое луиок сливают и отмывают от несвязавшихся компонентов 4 раза ТФБ. Конъюгат к соответствующему вирусу разводят ТФБ до концентрации 1-т-2,5 мкг/мл по пероксидазе (изменение концентрации конъюгата зависит от аффинности используемых антител) и добавляют в лунки по 0,2 мл раствора. Инкубируют планшеты при 37°С в течение 1 ч и отмывают 4 раза ТФБ.
4. После отмывки вносят в лунки по 0,2 мл субстратной смеси на основе 5-АС (см. § 1 этой главы), инкубируют при комнатной температуре в течение 30—40 мии. Результаты ИФА регистрируют визуально или спектрофотометрически при А,=450 нм.
Интерпретация результатов анализа
На основании статистической обработки результатов анализа за иижний предел обнаружения данным методом принимают концентрацию вируса (или разведение анализируемого экстракта), при котором регистрируемая оптическая плотность продукта ферментативной реакции в два раза
превышает аналогичный показатель для гетерологичного вируса или отрицательного стандарта.
При анализе растительного материала за отрицательный уровень принимают усредненное значение оптической плотности продукта пероксидазлой реакции, полученное при анализе смеси экстрактов от здоровых растений. Например, среднее значение оптической плотности для отрицательных контрольных проб составляет 0,07 о. е. Нижней границей положительных результатов будет
0,07-2 ==0,14 о. е. Образцы, дающие оптическую плотность выше этой величины, считаются вируссодержащнми.
Количественная оценка содержания вируса в исследуемом материале проводится иа основании калибровочной кривой, отражающей изменение оптической плотности продукта ферментативной реакции при возрастании концентрации вируса в положительном стандарте.
При достаточности получения информации типа «да» или «нет» может проводиться визуальная оценка. В этом случае интенсивность окраски в измеряемых пробах сравнивается с иитеисивностью для отрицательного и положительного стандарта. При разбивке цветовой шкалы в этом диапазоне цветов результаты анализа могут фиксироваться условными обозначениями:
-----вирус отсутствует;
Н----материал заражеи;
-j—|—- материал сильно заражеи.
§ 6. Определение инсулина в сыворотке крови человека
Количественное определение инсулина является одной из мер, необходимых для диагностики и контроля эффективности лечении диабета.
Рассматриваемый ниже ИФА инсулина проводится методом последовательного насыщения (см. гл. 4, § 2), включающим связывание иммобилизованными антителами сначала определяемого инсулина, а затем конъюгата инсулина с пероксидазой и измерение ферментативной активности на носителе, величина которой пропорциональна начальной концентрации гормона.
Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
