Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
-3. В лунки, в зависимости от выбранного способа детекции ПХ, добавляют по 0,2 мл субстратной смеси для фотометрического или хемилюминесцентиого определения и проводят измерение аналогично описанному в § 6, п. 5 раздела Методика проведения анализа.
Интерпретация результатов
По данным измерения стандартных растворов строят калибровочный. график, по которому определяют концентрацию тироксина в исследуемых образцах,
§ 8. Определение тестостерона
Определение содержания стероидного гормона тестостерона (ТС) в сыворотке крови необходимо для диагностики ряда эндокринных заболеваний. Данные об уровне тестостерона в крови и ее следах также могут использоваться в судебно-медицинских исследованиях для идентификации половой принадлежности.
¦ В данном разделе, рассмотрён конкурентный метод ИФА, включающий конкуренцию адсорбированного на полистироле и определяемого тестостерона за центры связывания специфических антител, С последующим выявлением специфического комплекса иа твердой фазе меченными пероксидазой антивидовымн антителами (А. В. Захарычев и др., 1987).
Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
Антитела против тестостерона; конъюгат тестостерона с соевым ингибитором трипсина (ТС-СИТ); меченные пероксидазой аитиви-довые антитела; стандартные растворы с известной концентрацией ТС; реагенты для приготовления субстратной смеси иа основе о-фенйлендиамииа; полнсти-рольные планшеты для ИФА; автоматические пипетки; спектрофотометр,
Получение конъюгата ТС-БСА и ТС-СИТ
Конъюгаты ТС-БСА и ТС-СИТ получены при связывании ТС-2-(о-карбоксиметилоксим) с белками методом смешанных ангидридов (см. гл. 7, § 1).
Антитела к тестостерону
Антисыворотки к тестостерону получают иммунизацией кроличьим конъюгатом ТС-БСА, в котором с молекулой белка связано не меиее 20 молекул гормона. Отбор пригодных для анализа антисывороток проводят стандартным методом ИФА, используя планшеты с адсорбированным конъюгатом ТС-СИТ и меченные ПХ антикроличьи антитела. Используют аити-сыворотки, имеющие в ИФА титр 10-4—10-5. За титр принимают максимальное разведение исследуемой сыворотки, при котором регистрируемое значение оптической плотности продукта ферментативной реакции достоверно отличается от значений, полученных для . нормальной сыворотки в том же разведении. В качестве нормальных используют кроличьи сыворотки, взятые до иммунизации.
Методика проведения анализа
1. В лунки полистирольных планшетов для ИФА добавляют по 0,2 мл раствора конъюгата ТС-СИТ в ФБ с концентрацией 1 мкг/мл. Инкубируют в течение ночи при 4°С, затем отмывают лунки водопроводной водой и ТФБ.
'2. Для построения калибровочной кривой в отмытые лунки вносят по 0,1 мл стандартных растворов ТС в метаноле с известной концентрацией гормона (от 0 до 50 иг/мл) и по 0,1 мл специфической аитисыворотки в разведении 1:10 000. В другие лунки вносят по 0,1 мл экстракта из препарата крови и
0,1 мл антисыворотки в этом же разведении. В контрольные лунки добавляют по 0,1 мл нормальной сыворотки в аналогичном разведении. Инкубируют 18 ч при 4°С, затем отмывают луики ТФБ.
3. Добавляют в лунки по 0,2 мл раствора конъюгата аитиЛдС-кролика с пероксидазой в ТФБ, с концентрацией по ИХ 1—2 мкг/мл. Инкубируют 1 ч при 37°С, отмывают ТФБ и добавляют по 0,2 мл субстратной смеси иа основе о-феиилендиа мииа.
4. Через 30 мин останавливают ферментативную реакцию добавлением 50 мкл 2 М H2SO4 и регистрируют оптическую плотность раствора при N = =490 им.
Интерпретация результатов
По данным измерения стандартных растворов строят калибровочный график и определяют по нему концентрацию тестостерона в экстракте.
Экстракция тестостерона из сыворотки
крови
Используемый в п. 2 раздела методики экстракт получают следующим образом. К 0.5 мл образца плазмы' (сыворотки) добавляют 10-кратиый избыток серного эфира (по объему), встряхивают 10—15 мии, затем помещают пробирку в морозильную камеру. После замерзания осадка иадоса-дочиую жидкость (эфирная фракция) сливают и упаривают в водной баие при 40—45°С досуха. Сухой остаток разводят ТФБ до начального объема образца и используют для дальнейшего анализа,
Заключение
Первые работы по иммуноферментному анализу появились в начале 70-х годов. За это время данное направление стало одним из ведущих в области количественного и качественного определения антигенов и антител ИФА, с помощью которого детектируют химические и биологические соединения различной природы и молекулярной массы — от гаптенов до бактериальных клеток.
