Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
В основу этого раздела положены результаты работы по созданию ИФА ротавируса, обобщенные в методических рекомендациях (Г. Ф. Коромыслов и др., 1984), утвержденных отделением ветеринарии ВАСХНИЛ.
Реагенты, материалы и оборудование,
необходимые для проведения анализа
Ротавирусный антиген, специфические антитела против ротавируса (АТ), конъюгат специфических антител с пероксидазой (Ат-ПХ), аитивидовые антитела против иммуноглобулинов быка, меченные пероксидазой (АтрПХ), положительные и отрицательные стандарты для выявления ротавируса и специфических антител, компоненты для приготовления субстратов на основе 5-АС (см. § 1 этой главы), полистирольные планшеты, микропипетки, спектрофотометр,
Получение ротавирусного антигена
1. Ротавирусный специфический антиген — вируссодержащая суспензия, полученная путем размножения ротавируса в культуре клеток МА-104, концентрированная полиэтиленгликолем (Afr=6000) и отцеи-трифугироваиная при бобоя. Антиген проверен на специфичность с эталонной антиротавирусной сывороткой в РДП. Антиген лиофилизоваи в ампулах по 1 мл. Срок годности 1 г. (может быть продлен после проверки в реакции ИФА). В качестве контроля используют нативную или лиофилизованиую суспензию иеиифицированных клеток МА-104.
Получение антител
1. Сыворотка специфическая аитиротавирусиая получена гнпериммуиизацией кроликов вирусом, очищеииым в градиенте плотности хлорида рубидия, Лиофилизоваиа в ампулах по 1 мл, Срок годности сухой сыворотки 3 г.
2. Иммуноглобулины выделены из гипериммуииой аитиротавирусной сыворотки высаливанием насыщенным раствором сульфата аммония с последующей ионообменной хроматографией иа колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Лиофилизова-иы в ампулах по 1 мл. Срок годности лиофилизоваииого препарата 1 год (может быть продлен после проверки в ИФА). В качестве контроля используют иммуноглобулины, выделенные по аналогичной методике из сыворотки крови, не содержащей антител к ротавирусу.
3. Аитисыворотку кролика против иммуноглобулинов быка получают гипер-иммуиизацией по стандартной методике. IgG-фракцию аитисыворотки выделяют как описано в п. 2.
Получение конъюгатов антител с пероксидазой
1. Синтез конъюгатов Ат-ПХ и Ат^ПХ осуществляли перйодатиым методом согласно методике, описанной в гл. 7. Выделение, характеристику и хранение конъюгатов проводили аналогично описанным ранее методикам.
Испытуемый материал и его отбор
1. Определение ротавируса проводят з материале от больных и павших телят (фекалии, тонкий отдел кишечника). Пробы фекалий отбирают в стерильные флаконы. Для исследования используют жидкую часть фекалий или супернатант 20—30%-ной суспензии фекалий или кишечника. При приготовлении суспензии кусочек кишечника измельчают и растирают в ступке до образования однородной массы. Суспензию промораживают в течение 18— 20 ч при —10°С, осветляют центрифугированием при 3000 g в течение 20 мни и иадосадочиую жидкость используют для исследования в ИФА.
2. Сыворотки получают от животных в количестве 5—6 мл, хранят в замороженном состоянии. Допускается их консервирование мертиолатом (1 : 1000) или добавлением антибиотиков. Сыворотку молозива или молока получают по общепринятой методике путем обработки их сычужным ферментом.
Положительные и отрицательные контроли (стандарты) для выявления ротавирусного антигена и антител
1. Количественное определение вируса или антител н исследуемом материале проводят при использовании калибровочных зависимостей оптической плотности продукта пероксидазной реакции от содержания вируса или антител в положительных и отрицательных стандартных пробах. При необходимости определения концентрации вирусных частиц в исследуемой пробе положительный стандарт получают путем внесения известного количества очищенного вируса в материал (фекалии, фрагменты тонкого отдела кишечника) от здоровых животных, ие содержащий ротавируса. Этот же материал используется в качестве отрицательного стандарта.
2. Если для целей исследования достаточным является знание относительного содержания вируса, то в качестве положительного и отрицательного стандарта используется материал от заведомо больного и достоверно здорового животного.
3. При определении антител в качестве положительного и отрицательного стандартов используется пул сывороток крови и молозива от больных и здоровых животных,
Методика проведения ИФА для выявления
ротавирусного антигена
1. В луики полистирольиых плаишетоз вносят по
