Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
0,2 мл раствора специфических иммуноглобулинов в ФБ в концентрации 5 мкг/мл и инкубируют в течение 18 ч при 4°С или 2 ч при 37°С. Затем удаляют раствор белка и 3—4 раза отмывают луикп ТФБ.
2. В лунки с иммобилизованными иммуноглобулинами вносят по 0,2 мл специфического (положительного), контрольного (отрицательибго) и исследуемых антигенов в разведении 1 :50. Одновременно проводят титрование положительного и отрицательного антигенов. Пробы разводят ТФБ. Тщательно перемешивают в течение 5—7 с и инкубируют в термостате 1,5—2,0 ч при 37°С. Затем трижды отмывают луики от иесвязавшихс.я антигенов ТФБ. При качественной постановке реакции (ответ «есть» или «нет») постановку осуществляют аналогично, ио материал ие титруют, а ставят ие менее трех повторных опытов с разведением 1 : 50.
3. В отмытые луики вносят по 0,2 мл раствора конъюгата Ат-ПХ в ТФБ с концентрацией 2000 иг фермента в 1 мл, инкубируют 1,5 ч при 37°С и отмывают луики ТФБ. Затем добавляют 0,2 мл субстратной смеси на основе 5-АС.
4. Через 40 мии реакцию останавливают внесением в каждую луику по одной капле 5N. НС1. Оптическая плотность образующегося продукта реакции пропорциональна содержанию аитигеиа в исследуемых пробах.
Методика проведения ИФА для выявления
антиротавирусных антител
1. В лунки планшетов вносят по 0,2 мл раствора специфического аитягеиа (см. с. 273) в ФБ с концентрацией 10 мкг/мл и инкубируют в течение 18 ч при 4°С. Затем удаляют раствор антигена и 4— 5 раз- отмывают луики ТФБ.
2. В луики с адсорбированным антигеном вносят по 0,2 мл стандартных — положительной и отрицательной и исйытываемых сывороток в разведении 1 :30. Для количественного определения антител в сыворотках их титруют последовательным двукратным разведением в ТФБ, начиная с разведения 1 :30. Тщательно перемешивают в течение 5—7 с и инкубируют в термостате 1,5—2 ч при 37°С. Затем 4—5 раз луики отмывают от иесвязавшихся антител ТФБ. При качественной постановке реакции (ответ «есть» или «иет») постановку осуществляют аналогично, ио сыворотки ие титруют, а ставят ие менее трех повторных опытов с разведением 1 :30.
3. В отмытые лунки вносят по 0,2 мл раствора конъюгата (АтгПХ) в ТФБ в концентрации 2000 иг фермента в 1 мл, инкубируют 1,5—2,0 ч при 37°С и отмывают луики тем же раствором. Затем добавляют 0,2 мл субстратной смеси иа основе 5-АС.
4. Через 30 мии реакцию останавливают внесением в каждую луику по одной капле 5N НС1 и измеряют оптическую плотность.
Интерпретация результатов
Инструментальная регистрация результатов анализа проводится спектрофотометрически при А,=450 им.
При отсутствии необходимости строгого количественного определения содержания вируса или антител учет результатов ИФА может проводиться визуально, по цветовой шкале зависимости интенсивности окраски продукта перокси-дазиой реакции от содержания исследуемого соединения.
1. При определении концентрации антигена значение оптической плотности, полученное при анализе исследуемой пробы, сравнивается с калибровочными графиками титрования положительного и отрицательного стандартов, Концен-
трация вируса в исследуемом материале определяется умножением значения, полученного по калибровочному графику, иа разведение пробы при анализе.
Для большей достоверности результатов исследуемый материал рекомендуется анализировать в нескольких разведениях, а искомую концентрацию вируса определять как среднее.
2. При качественном определении вируса (ответ «есть» или «иет») его наличие считается доказанным, если регистрируемая оптическая плотность продукта ферментативной реакции в случае испытуемой пробы более чем а 2 раза превышает среднее значение оптической плотности отрицательного стандарта.
3. Исследуемая иа содержание специфических антител сыворотка считается сероположительиой, если среднее значение регистрируемой оптической плотности продукта пероксидазиой реакции превышает соответствующее значение для отрицательного стандарта (Л) ие меиее чем в 3 раза среднеквадратичную ошибку определения А (см. гл. 10, § 3).
4. При визуальной оценке результатов реакции интенсивность окраски продукта пероксидазиой реакции, измеренная при анализе исследуемого материала, сравнивается с интенсивность^ окраски, полученной для положительного и отрицательного стандарта в тех же разведениях. Качественную оценку наличия вируса или антител в образце удобно проводить по цветной шкале:
+++Н-------интенсивное коричневое окрашивание;
++4-----коричневое окрашивание;
----светло-коричневое окрашивание;
----окрашивание отсутствует или находится иа уровне отрицательного контроля.
§ 5. Определение вирусов картофеля
Своевременное выявление вирусов в посевном материале и выбраковка зараженных растений являются одним из способов борьбы с заболеваниями картофеля, приводящими к значительному снижению урожайности этой культуры.
