Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
В основе этого раздела лежат данные по разработке ИФА вирусов картофеля (А. Ф. Бобкова и др., 1983; Н. М. Напвлишвили и др., 1985), обобщенные в методических рекомендациях (И. Г. Атабеков и др., 1985), утвержденных отделением защиты растений ВАСХНИЛ.
Идентификация вирусов проводится «сэндвич»-методом ИФА, включающим последовательное взаимодействие вируса с адсорбированными иа полистироле антителами, а затем с конъюгатом антител с пероксидазой. Измеряемая активность фермента иа твердой фазе пропорциональна начальной концентрации вируса и служит характеристикой его содержания в исследуемом образце.
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа
Вирусы картофеля (X, Y, М, S); специфические антитела против вирусов; конъюгат специфических антител с пероксидазой; положительный и отрицательный стандарты; субстратная смесь для определения пероксидазиой активности иа основе 5-АС (см. § 1 дайной главы); полисти-рольиые планшеты; автоматические пипетки; спектрофотометр.
Получение высокоочищенных вирусных препаратов
1. X, Y, М, S вирусы картофеля (ХВК, YBK, МВК н SBK соответственно) выделяют из специально зараженных растений. Схема Выделения включает гомогенизацию листьев, осветление экстракта центрифуги-
роваиием и встряхиванием с четыреххлористым углеродом. К осветленному Экстракту добавляют ПЭГ-115, отделяют полученный осадок центрифугированием и трижды экстрагируют 0,005 М боратиым буфером, pH 7,5. Дальнейшая очистка вирусов проводится ультрацеитрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Полученный осадок дважды экстрагируют буфером и концентрируют вирус дифференциальным центрифугированием при 80—100 тыс. g.
Выделяемые таким образом препараты вирусов не содержат пигментов ра-стення-хозяииа и характеризуются типичным для нуклеопротеидов спектром поглощения в ультрафиолетовом свете (максимум при 1=260—265 им, минимум при А,=247 им). Соотношение Егво/Егзо составляет для ХВК 1,2; УВК—1,15— 1,20; МВК и SBK—1,2—1,25. Коэффициент седиментации в зависимости от вируса и растворителя находится в пределах 115—200 S. Очищенный препарат не должен реагировать с антисывороткой, приготовленной к экстракту из здоровых растений; в электронном микроскопе должны обнаруживаться в препаратах только нитевидные вирионы.
Препараты вирусов хранятся в течение длительного времени при —20°С в присутствии 50%-иого глицерина.
Получение антисывороток к вирусам
картофеля
1. Первая инъекция: 1 мг аитигеиа вводится кролику внутривенно.
2. Вторая инъекция (через 4 недели): 1 мг антигена в смеси с полным адъювантом Фрейида вводится подкожно в несколько точек иа спине животного.
3. Третья инъекция (через 2 недели): 1 мг вируса в смеси с адъювантом Фрейида вводят подкожно в несколько точек иа спиие животного или в мышцы обеих задних йог.
.4. Кровь собирают в период между 2-й и 4-л неделями, считая от последней-инъекции. Через 4 недели проводят реиммуиизацию. Для этого 1 мг вируса в смеси с полным адъювантом Фрейнда вводят подкожно в несколько точек или внутримышечно в две точки.
Титры сывороток, полученных пб предлагаемой схеме, достигают в среднем 2,5-10~2—5-10-2 в методе капельной преципитации и 10~5—10-6 в методе ИФА.
Для работы используют моноспецифические аитисыворотки-, в которых отсутствуют антитела к компонентам клетки здорового растения. Нарушение этого условия приводит к значительному увеличению ложно положительных результатов при проведении анализа.
Выделение иммуноглобулинов
Иммуноглобулины выделяют из аитисывороток по
• следующей схеме:
1. 2 мл аитисыворотки разводят 1 : 1 дистиллированной водой п добавляют равный объем 20%-иого водного раствора полиэтилеигликоля (ПЭГ) с М,= = 6000.
2. Центрифугируют при 8000 об/мии в течение 15 мии, осадок растворяют ' в 4 мл ФБ,
3. К 4 мл растворенного осадка добавляют 4 мл 20%-иого водного раствора ПЭГ и центрифугируют вторично при 8000 об/мии в течение 15 мии.
4. Осадок растворяют в 1 мл ФБ и диализуют против этого же буфера в течение ночи.
5. Концентрацию иммуноглобулинов определяют спектрофотометрически по формуле А28оУ\фактор разведения-0,77=С[мг/мл], где Лаво—оптическая плотность раствора при Х=280 нм; С — концентрация иммуноглобулинов в растворе,
6. Хранят иммуноглобулины либо в 50%-ном глицерине, либо при —20°С в растворе с конечной концентрацией белка 1 мг/мл. Перед связыванием с пероксидазой иммуноглобулины прогревают при 56°С в течение 30 мии для увеличения стабильности конъюгата при хранении.
Получение конъюгата иммуноглобулинов
с пероксидазой (Ат-ПХ)
1. Синтез конъюгата Ат-ПХ осуществляют перйодат-ным методом по методике, описанной в гл. 7, § 2. Выделение, характеристику и хранение коиъюгата осуществляют как описано ранее.
