Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
бумажную электро-фореграмму и для разделения аминокислот подвергают
электрофорезу. Вещества, имеющие гуанидиновую группу (рис.6.20), такие,
как аргинин и нопалин, визуализируют с помощью метода чувствительного
флуоресцентного окрашивания, при котором используют фенантренхинон.
6.10.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение 1 [I])
- Прибор для горизонтального электрофореза на бумаге (Shandon или
аналогичный).
- Кювета для окрашивания электрофореграммы (Shandon).
- Фен и держатель для него.
- Магнитная мешалка.
- Тяга.
- Пластмассовые одноразовые палочки (Sarstedt).
- Микрокапилляры (20 по 5 мкл и 5 по 1 мкл; Drummond Scientific).
- Хроматографическая бумага Whatman ЗММ.
- Фильтровальная бумага с полиэтиленовой подстилкой (Benchkote) (25x30
см).
- Стакан для отходов на 250 мл.
- Промывалка с дистиллированной водой.
-- Вата.
- Пластмассовое чайное ситечко.
- Термостат на 25°С.
- Образцы растительной ткани.
Растворы
- Инкубационная смесь для нопалинового теста (NIM) (10 мМ аргинина и 10
мМ а-кетоглутаровой кислоты в MSP1). На
100 мл:
Аргинин 210,0 мг
сс-Кетоглутаровая кислота 168,0 мг.
Растворяют в среде MSP1 (приложение 2 [II]). Хранят при -20 °С.
- Стандартные растворы аргинина и нопалина (Sigma): растворяют в
дистиллированной воде в концентрации 1 мг/мл.
Анализ организации и экспрессии генов растений
При -20 °С растворы стабильны в течение нескольких лет.
- Буфер для электрофореза (муравьиная кислота/уксусная куслота/вода, 5
: 15 : 80). На 1 литр:
Муравьиная кислота (BDH) 50,0 мл
Ледяная уксусная кислота (BDH) 150,0 мл
Дистиллированная Н20 800,0 мл.
Если буфер хранят в посуде с притертой пробкой, он остается
стабильным в течение нескольких месяцев и после перемешивания может
использоваться многократно.
Примечание: необходимо работать под тягой в перчатках и фартуке,
поскольку буфер для электрофореза представляет собой сильную кислоту, и
его пары оказывают раздражающее воздействие.
- Растворы для окрашивания гуанидиновой группы: непосредственно перед
использованием готовят свежие растворы:
А: 2 мг фенантренхинона (BDH) в 10 мл 100%-ного этанола. В: 1 г NaOH
в 10 мл 60%-ного этанола.
Вносят 2 мг фенантренхинона (BDH) в 10 мл 100%-ного этанола в
пластмассовой пробирке и перемешивают на магнитной мешалке до полного
растворения. В отдельной пробирке растворяют 1 г NaOH в 10 мл 60%-ного
этанола. Вливают раствор NaOH в раствор фенантренхинона, закрывают
крышкой, перемешивают и затем выливают в кювету для окрашивания. Следует
соблюдать осторожность, поскольку раствор очень едкий.
6.10.3. Методика
1. Собирают 100-200 мг изучаемой ткани, помещают ее в пробирку
Эппендорф, содержащую 500 мкл NIM и инкубируют в течение ночи при 25°С.
2. Промывают ткань дистиллированной водой (в сите над стаканом для слива
отходов) и подсушивают материал.
3. Гомогенизируют ткань в пробирке Эппендорф пластмассовой палочкой.
4. Осаждают клеточный дебрис (2 мин на высокой скорости в мини-
центрифуге) и используют супернатант, как описано на стадии 6а).
5. Работая на новом куске фильтровальной бумаги с полиэтиленовой
подстилкой (Benchkote), размечают и складывают хроматографическую бумагу,
как показано на рис. 6.21. Наносят образцы, отступая 3,5 см от анода, на
расстоянии 1 см друг от друга в порядке, предложенном в табл. 6.3.
(Примечание: все пометки делать мягким карандашом.)
а) Заполняют микрокапилляр на 5 мкл экстрактом ткани.
380
Глава 6
б) Наносят пятна по возможности меньшего размера, несколько раз касаясь
капилляром фильтровальной бумаги, пока весь экстракт не выйдет из него
под действием капиллярных сил. Работают под струей теплого воздуха из
фена.
в) После высыхания добавляют к соответствующим пятнам по 1 мкл
стандартного раствора нопалина или аргинина (1 мг/мл)р).
3,5 см
23 см
t см ?
3,5 см
I
Рис. 6.21. Разметка бумаги для определения опнна путем электрофореза.
6. Работая под тягой, вносят по 500 мл буфера для электрофореза в каждую
камеру(r)). Следует убедиться, что источник напряжения подключен и контакты
погружены в буфер.
7. Работая в перчатках под тягой на новом листе фильтровальной бумаги с
полиэтиленовой подстилкой (Benchkote), увлажняют электрофореграмму
буфером для электрофореза с помощью ваты, стараясь не задеть полоску у
старта шириной 1 см. Быстро помещают бумагу в прибор для электрофореза,
расположив зону старта со стороны анода ( + ). Следует убедиться, что
концы бумаги полностью погружены в буфер и в других точках бумага не
соприкасается с буфером. Постепенно выводят напряжение до 400 В и
проводят электрофорез в течение 45 мин.
Катод
1 I I I I I I t I
