Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
литературе [41], и их следует придерживаться при работе с материалом
другого типа.
2. Помещают срезы в раствор для фиксации и быстро (1 мин) пропитывают им
ткани с помощью отсоса.
3. Инкубируют в фиксаторе в течение 45 мин при комнатной температуре и
затем несколько раз промывают в 50 мМ NaPCU, pH 7,0.
4. Переносят срезы в 1-2 мл раствора гистохимического реактива (X-GLUC) и
затем инкубируют при 37 °С от 20 мин до нескольких часов (в зависимости
от интенсивности окрашивания). Известны и другие методы окрашивания3)-б\
5. После окрашивания промывают срезы 70%-ным этанолом в течение 5 мин,
затем помещают на предметные стекла и просматривают под микроскопом.
Примечания
а) Вместо X-GLUC для гистохимической реакции можно использовать наф-тол-
АБВЬглюкуронид, как описано ниже [27].
Инкубируют ткани или готовые препараты, зафиксированные формальдегидом
или глутаральдегидом в 0,1 М NaP04 (pH 7,0) с добавлением 1 мМ нафтол-
АБВЬглюкуронида во влажной камере при 37 °С. Если фермента очень мало,
может возникнуть необходимость в более длительной инкубации, однако при
этом продукт реакции диффундирует и точность выявления снижается. Образцы
промывают фосфатным буфером и обрабатывают диазотирующим красителем в
фосфатном буфере. После реакции азосочетания хорошие результаты можно
получить, обрабатывая срезы приблизительно 1 мин раствором Fast Garnet
GBC (1 мг/мл в фосфатном буфере, pH 7,0); затем срезы промывают и готовят
препараты для световой микроскопии.
б) Кроме того, условия, приведенные в изложенной выше методике, могут
быть изменены в зависимости от типа ткани:
1) X-GLUC можно использовать, начиная от концентраций 1-2 мМ в
фосфатном буфере (50 мМ NaP04, pH 7,0).
2) Время инкубации можно увеличить (например, провести ее в теченнэ
ночи). С увеличением продолжительности анализа точность выявления
снижается незначительно.
3) Рекомендуется использовать катализаторы окисления, например смесь
0,1 мМ феррнцнанида калня и 0,1 мМ ферроцианида калия. Катализатор
незначительно подавляет активность фермента, но выявление продукта прн
этом иногда улучшается. Чтобы в какой-то степени уменьшить эффект
ингибирования, оказываемый катализатором, в инкубационную смесь можно
добавить 1 мМ ЭДТА. После окрашивания среза ткани во многих случаях, по-
вндимому, контраст повышается при осветлении 70%-ным этанолом.
Анализ организации и экспрессии генов растений
377
6.10. Определение нопалина в трансформированных растительных тканях
6.10.1. Общие положения
Одна из наиболее подробно изученных функций Т-ДНК в опухолях
корончатых галлов-экспрессия транскрипта 3, который в опухолях
октопинового и нопалинового типа кодирует опинсинтазу. Нопалинсинтаза
катализирует синтез нопалина из аргинина и а-кетоглутаровой кислоты (рис.
6.20). Данный фер-
Аргинин о-кетоглутаровая кислота
I NH | + О
II II
j H2N -С - NH-СН2уСН2 - сн2-сн-соон ноос-СН2-СН2-СИ-соон
nh2
I
I
NH
II
HjN-С-NH -СН2-СН2-СНг-СН-СООН
I
N +НгО
I
НООС-СН2-СН2-СН-СООН .-------------------
nadh2
NH "NAOH
II
H2N -С -NH -СНг-СН2 -СНг-СН-СООН
I
NH
I
НООС- снг-сн2-сн-соон
Нопалин
Гуанидиновая группа окрашивается фенантренхиионом
Рис. 6,20. Биосицтез нопалина.
мент широко используется в экспериментах по транскрипции как селективный
маркер. Среди генов Т-ДНК нуклеотидная последовательность гена
нопалинсинтазы была определена первой. Оказалось, что его промотор сходен
с эукариотическим и в состав гена нопалинсинтазы входят
последовательности, обеспечивающие полиаденилирование. Эти особенности
впоследствии использовались для конструирования многих химерных генов и
было показано, что они контролируют экспрессию генов в трансформированных
тканях растений [24]. С помощью простого электрофоретического анализа на
бумаге по наличию нопалина можно проводить отбор трансформированного
растительного материала из самых разнообразных источников. Ткани сперва
на-
378
Глава 6
сыщают аргинином и а-кетоглутаровой кислотой. Затем избыток аргинина
отмывают, ткани подсушивают фильтровальной бумагой и размалывают. Грубый
экстракт вместе с аргинино-вым и нопалиновым контролями наносят на
