Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Дрейпер Дж. -> "Генная инженерия растений. Лабораторное руководство" -> 169

Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.

Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство — М.: Мир, 1991. — 408 c.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка): gennayainjeneriyarasteniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 163 164 165 166 167 168 < 169 > 170 171 172 173 174 175 .. 184 >> Следующая

t см 1_________L
I I \ I 1 1- I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
15 16 17 18
Анод

Сгиб
Линия,
проведенная:
карандашом
Сгиб
Анализ организации и экспрессии генов растений
381
Таблица 6.3. Порядок нанесения образцов на электрофореграмму для
определения опина (рис. 6.21).
Дорожка Образец (5 мкл) Стандартные рас
творы (1 мкл)
1 Аргинин+нопалин
2 Полож. контроль (опухоль Nop+) ---
3 Полож. контроль (опухоль Nop+) Нопалин
4 Отриц. контроль (нетрансформированная ---
ткань)
5 Отриц. контроль (нетрансформированная Нопалинб>
ткань)
6 Трансформант 1 ---
7 Трансформант 1 Нопалин
(Дорожки 8-13 наносятся в том же порядке, что и дорожки 6 и 7 с
экстрактами других трансформированных тканей)
41 | - | Аргнннн
8. После окончания электрофореза высушивают бумагу (зоной старта вверх)
в струе теплого воздуха под тягой.
9. Пока электрофореграмма подсыхает1-), готовят растворы для
окрашивания А и В.
10. Смешивают по 10 мл каждого реагента А и В в кювете для окрашивания и
проявляют электрофореграмму, осторожно протягивая бумагу через краситель
зоной старта вперед. Затем электрофореграмму следует повесить для
просушки под струей холодного воздуха под тягой (зоной старта вверх) на
20 мин.
11. Просматривают электрофореграмму при УФ-освещении и фотографируют
камерой "Поляроид", снабженной оранжевым фильтром. Нопалин и аргинин дают
зеленую флуоресценцию, которая при освещении дневным светом быстро
пропадает.
12. Пример электрофореграммы при определении нопалина приведен на рис.
6.22. Следует отметить более низкую подвижность нопалина в неочищенных
экстрактах растений по сравнению со стандартами. Негативный контроль не
содержит нопалина (дорожка 4). Предполагаемый трансформант 1 (дорожки 6 и
7) содержит некоторое количество но-палияа, а предполагаемый трансформант
2 не содержит. Последнее свидетельствует о том, что либо это не
трансформант, либо ген нопалинсинтазы по каким-то причинам не активен.
Примечания
а) Если супернатанта получилось мало, следует еще раз гомогенизировать
материал и размешивать дольше. Если ткани очень плохо экстрагируют-
382
Глава 6
1 2 3 4 5 в 7 8
Э 10 11 12 13 14
Рис. 6.22. Определение нопалина в трансформированных тканях растений.
Дорожка I - нопалиновый и аргининовый стандарты; 2 - положительный
контроль (опухолевая ткань, синтезирующая нопалин); 3 - то же, что и 2 с
добавлением нопалина; 4 - отрицательный контроль (нетрансформированная
ткань); 5 - то же, что и 4 с добавлением нопалина; 6 - предположительный
трансформант I; 7 - предположительный трансформант I с добавлением
нопалина; 8-¦ I3 - как 6 н 7 с другими экстрактами предположительно
трансформированных тканей, через дорожку в образец добавлен нопалин, I4 -
аргининовый стандарт.
ся, перед повторным растиранием можно добавить небольшое количество
дистиллированной воды (5-Ю мкл).
в) Нопалин в параллельные пробы добавляют для того, чтобы оценить
снижение подвижности этого вещества в присутствии неочищенного
растительного экстракта. Это обусловлено взаимодействием в экстракте
нопа-лйна с углеводами, а также иными аминокислотами, чем аргинии и
нопалин. Поскольку в экстрактах содержатся вещества, способные к
флуоресценции (при освещении УФ), и другие соединения, содержащие
гуанидин, важно точно определить подвижность нопалина в неочищенных
экстрактах, чтобы отличить его от различных загрязняющих пятен.
(r)> Буфер для электрофореза очень кислый и образует вредные пары, поэтому
все работы следует проводить под тягой. г> Перед окрашиванием
электрофореграмма должна быть абсолютно сухой.
Анализ организации и экспрессии генов растений
383
Приложение 6 [I]
Нозерн-блоттинг
Данный метод можно использовать как для исследования тотальной РНК,
так и poly(А)+-РНК. Размер РНК определяют относительно зон рибосомной
РНК- На гель просто наносят дополнительную дорожку тотальной РНК, после
электрофореза отдельно окрашивают ее бромистым этидием и фотографируют
рядом с линейкой.
Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Тяга.
- Агароза (Miles Scientific: SeaPlaque HGT).
- Водяные бани на 55 и 60 °С.
- Нитроцеллюлозный (Schleicher and Schuell, ВА-85) или най-лоновый
фильтр (Hybond-N).
- Прибор для горизонтального электрофореза и источник питания.
Предыдущая << 1 .. 163 164 165 166 167 168 < 169 > 170 171 172 173 174 175 .. 184 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed