Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
386
Глава 6
весьма высоки, в большинстве случаев достаточно просто озвучить культуру
бактерий на стадии экспоненциального роста я использовать неочищенный
экстракт.
Примечание: всю работу следует проводить при 4 °С.
1. Выращивают 20 мл бактериальной культуры с антибиотиком (100 мкг/мл
канамицина или 25 мкг/мл хлорамфеникола) до плотности 4Х108 клеток/мл и
собирают клетки центрифугированием (7000 об/мин, 20 мин).
2. Ресуспендируют клетки в 500 мкл 10 мМ трис-HCl (pH 7,4), 10 мМ MgCl2,
25 мМ NH4C1, 0,6 мМ 2-МЭ (или 2,0 мМ ДТТ).
•3. Озвучивают на льду импульсами 3X5 с; в промежутках охлаждают на льду
в течение 2-3 мин.
4. Центрифугируют для удаления дебриса (16 000 об/мин).
5. До использования хранят при -20 °С.
Приложение 6 [III]
Определение концентрации белка по Брэдфорду
При необходимости концентрацию белка можно определить в реакции
Брэдфорда [7]. Раствор для определения готовят ^следующим образом: 100 мг
кумасси синего G-250 растворяют в 50 мл 95%-ного этанола и 100 мл 85%-ной
(вес на объем) фосфорной кислоты, затем доводят до 1 л дистиллированной
НгО. Раствор оставляют на ночь и затем фильтруют через фильтровальную
бумагу Whatman № 1.
Для каждого определения используют компоненты в следующем соотношении:
Образец 100 мкл
Дистиллированная Н20 1 мл
Раствор для определения 1 мл
Определяют поглощение пробы при 595 нм. Строят калибровочную кривую,
используя БСА в концентрациях от 0 до 100 мкг.
Приложение 6 [IV]
Определение агропина и маннопина
Некоторые виды растений трансформируют с использованием штаммов
A.rhizogenes, несущих бинарные векторы (приложение 2 [VIII]). Агропин и
маннопин (в зависимости от штамма) представляют собой удобные маркеры для
выявления Ri-генов Т-ДНК в клонах тканей и растений, регенерировавших из
опухолей косматых корней. Метод достаточно чувствителн и за-
Анализ организации и экспрессии генов растений
387
ключается в проведении простого электрофореза на бумаге; оборудование и
растворы те же, что и для определения нопалина (разд. 6.10). Агропин и
маннопин - это производные сахаров, и для их определения используют
нитрат серебра.
1. Растирают 50-100 мг свежей ткани в пробирке Эппендорф с равным
объемом этанола. Альтернативный путь - дважды экстрагируют 10 мг ткани 40
мкл дистиллированной Н20 в течение 10 мин.
2. Центрифугируют экстракт в мини-центрифуге в течение 5 мин и
переносят супернатант в чистую пробирку3).
3. Концентрируют образец вакуумным центрифугированием или
лиофилизацией, уменьшив первоначальный объем на 75%. Кроме того, можно
сконцентрировать образец, выдувая избыток этанол/дистиллированная Н20
потоком сжатого воздуха при температуре образца 60 °С.
4. Наносят 10-15 мкл экстракта на электрофореграмму, как описано в
разд. 6.10.
5. Проводят электрофорез, как описано в разд. 6.10, и высушивают в
потоке холодного воздуха.
6. Погружают электрофореграмму (начиная с отрицательного полюса) в 100
мл реагента Аб> и затем быстро высушивают.
7. Когда электрофореграмма высохнет, погружают ее в 100 мл реагента Бб)
и высушивают.
8. Фиксируют окрасившиеся пятна, погружая электрофореграмму в реагент
Сб> или готовый фотофиксаж.
9. Промывают в течение 30 мин под струей водопроводной воды и затем
высушивают.
10. О наличии агропина или маннопина (в зависимости от штамма
A.rhizogenes, используемого при трансформации) судят по темно-коричневым
или черным пятнам на расстоянии 5-8 см от старта.
Примечания
s) В некоторых экстрактах, особенно полученных из опухолей косматых
корней, агропин можно определять, не концентрируя экстракт.
в) 1) Готовят насыщенный раствор AgNC>3 (2,5 г/мл). Добавляют по каплям
0,5 мл насыщенного AgN03 к 100 мл ацетона, размешивая до исчезновения
всего осадка. Реактив можно повторно использовать для
5-10 определений.
2) Добавляют 10 мл 20%-ного (вес на объем) NaOH к 90 мл метанола.
Используют немедленно.
3) Растворяют 5 г тиосульфата натрия (Na2S203-5H20) в 100 мл Н20.
Литература
1. Apel К., Kloppstech К• (1978) The plastid membranes of barley
(Hordeum vulgare). Light induced appearance of mRNA coding for the
apoprotein of light-harvesting chlorophyll a/b protein. Eur. J. Biochem.
44, 581-8.
2. Berk A. J., Sharp P. A. (1977) Sizing and mapping early adenovirus
mRNAs
?88
Глава 6
by gel electrophoresis of SI endonuclease-digested hybrids. Cell 12,
721-32.
3. Bevan M. W. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant
transformation. Nucl. Acids Res. 12, 8711-21.
4. Bevan M. W., Flavell R., Chilton M.-D. (1983) A chimeric antibiotic
resistance gene as a selectable marker for higher plant transformation.
Nature 304, 184-7.
5. Bolivar F. (1978) Construction and characterisation of new cloning
vehicles. III. Derivatives of plasmid pBR322 carrying unique fcoRI sites
for selection for selection of EcoRI generated recombinant DNA molecules.
