Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
- Тотальная РНК для определения мол. массыа\
Растворы
Все реактивы, за исключением указанных особо, поставлены фирмой BDH
Analar.
Десятикратная MOPS (морфолинопропансульфоновая кислота) (20 мМ Na
MOPS, 90 мМ ацетат натрия, 10 мМ №2ЭДТА). На 1 литр:
Доводят pH до 7,0 NaOH. Хранят в темноте при 4°С.
- Формальдегид: 37%-ный раствор (12,3 М) в дистиллированной Н20. pH не
должен превышать 4,0.
- Диметилсульфоксид (ДМСО): деионизуют, перемешивая в течение 1 ч с 5 г
амберлита (BDH). Фильтруют через Whatman №1 и хранят при 4 °С.
- Буфер с хлористым литием (1,0 М LiCl; 0,05 М ЭДТА; 2%-ный ДСН; 0,01 М
трис-НС1, pH 6,5). На 100 мл:
Na MOPS Ацетат натрия Ыа2ЭДТА
41,86 г 7,40 г 3,72 г.
LiCl
0,5 М ЭДТА
дсн
2 М трис-НС1, pH 6,5
4,2 г 10,0 мл 2,0 г 0,5 мл,
384
Глава 6
- Буфер для денатурации:
Буфер с хлористым литием 1 объем
Деионизованный ДМСО 9 объемов.
- Буфер для нанесения на гель (25%-ный глицерин, 25 мМ ЭДТА, 0,5%-ный
ДСН, 0,4%-ный бромфеноловый синий). На 20 мл:
Глицерин 5,0 мл
0,5 М ЭДТА 1,0 мл
10%-ный ДСН 1,0 мл
1%-ный бромфеноловый синий 8,0 мл.
- Двукратный SSC (разд. 5.4.2).
Методика
1. Готовят гель, расплавив6) агарозу(r)) в НгО, охлаждают да 60 °С и
добавляют lOXMOPS до получения однократного раствора и формальдегид до
конечной концентрации 2,2 М. Например, на 100 мл 1,5%-ного геля:
Агароза (1,5 г) в 73,0 мл дистиллированной HjO
lOXMOPS 10,0 мл
Формальдегид 16,6 мл.
Работая под тягой, тщательно перемешивают и заливают гель. Толщина
геля должна составлять 3-5 мм. Заливать следует как можно быстрее, чтобы
избежать чрезмерного испарения формальдегида.
2. Готовят образцы РНК (5-20 мкг тотальной РНК или 50-• 100 нг poly(А)+-
мРНК в 4 мкл стерильной дистиллированной Н20), добавив 9 объемов буфера
для денатурации. Нагревают до 55°С в течение 15 мин. Непосредственно
перед нанесением проб на гель добавляют 0,25 объема буфера для
нанесения1').
3. Проводят электрофорез при 150 мА до тех пор, пока фронт красителя не
достигнет конца геля (для 2%-ного геля около 3 ч).
4. Отрезают дорожку с маркерами для окрашивания*). Промывают оставшийся
гель (осторожно, поскольку гели с формальдегидом хрупкие).
5. Переносят РНК на нитроцеллюлозный фильтр методом капиллярного
блоттинга (разд. 5.4)е).
6. Снимают фильтр, высушивают его на воздухе и прогревают в вакуумном
шкафу в течение 1 ч при 80°СЖ).
7. Гибридизуют с меченной ДНК пробой, как описано в разд. 5.5. Проба
должна быть помечена, как описано в разд. 5.6.
Анализ организации и.экспрессии генов растений
385
Примечания
*) В следующей таблице приведены примерные размеры (они варьируют у
разных видов) рибосомных РНК, обычно выявляемых при разделении в агарозе
тотальной РНК. См. также [18].
рРНК Примерное число нуклеотидных пар (п.
н.)
28S/25S (цитоплазматическая) 3580
.23S (хлоропластов) 2890
18S (цитоплазматическая) 1926
5S (цитоплазматическая нлн 120 нди 122.
хлоропластов)
(r)> Для приготовления агарозных гелей большей концентрации агарозу, чтобы
она не пригорала, следует расплавлять на кипящей водяной бане1.
>) Обычно 1,0-2,0%. Подробнее о фракционирующих свойствах гелей с
различными концентрациями агарозы, содержащих формальдегид, см. в
литературе [33].
г> Во избежание диффузии формальдегида гели следует погружать в
однократный раствор MOPS только непосредственно перед нанесением.
д) Часть геля окрашивают в течение 30-60 мин в 50-100 мл раствора
бромистого этидия 5 мкг/мл. Обесцвечивают в дистиллированной НгО (1-2 ч
или, если удобнее, в течение иочи) и визуализируют РНК под УФ-
трансиллюминатором.
*> Для нозерн-блоттинга пригодны и найлоновые фильтры, например Ну-bond-
N.
ж> После длительного прогревания нитроцеллюлозный фильтр становится
хрупким.
1 Удобнее это делать в микроволновой печи. - Прим, ред. пер.
Примечание переводчика
Названия "Нозерн"- и "Вестерн"-блоттинг возникли как игра слов. Дело в
том, что фамилия исследователя, разработавшего метод переноса ДНК на
нитроцеллюлозный фильтр, на русский язык переводится как "Южный"
(Southern). Когда появился метод переноса РНК на фильтр, ему в шутку было
дано как бы противоположное название - "Нозерн" (Северный). После
разработки метода переноса белков опять пришлось вспомнить стороны света,
и появилось название "Вестерн" (Западный). Интересно, появится ли
"Истерн"-блоттинг, а если появится, то где - на Западе или на Востоке.
Приложение 6 [И]
Выделение NPT-II и CAT из бактерий
Ферменты NPT-II и CAT можно выделить из штаммов Е. coli, содержащих
многокопийную плазмиду с соответствующими генами. Можно использовать и
плазмиды, содержащие эти гены в транспозонах: Тп5 и Тп9 для NPT-II и CAT
соответственно. В связи с тем что в таких штаммах уровни экспрессии
