Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
содержащем ДСН, приведен на рис. 6.19. Хорошо видно, что активность GUS в
растениях CaMV-GUS (дорожки 3-5) значительно выше, чем в растениях,
трансформированных РБФК МС-GUS (дорожки 1 и 2); эти данные иллюстрируют
относительную силу двух различных промоторов. Следует отметить, что табак
дикого типа не содержит GUS (дорожка 7).
Примечания
*> При необходимости эту стадию можно проводить при 4°С.
в) Для получения максимальной чувствительности и разрешения важно, что"-
374
Глава 6
бы инкубация при 37 °С протекала без жидкости на поверхности геля,
поскольку продукт реакции хорошо растворим и будет диффундировать.
*) Следует отметить, что определение мол. массы химерных белков GUS не
всегда надежно н интерпретация различий в размерах таких химерных
продуктов может быть затруднена.
6.9.7. Гистохимическое выявление GUS на срезах тканей растений
6.9.7.1. Общие положения
Следует отметить, что интерпретация данных при количественном
определении активности химерных генов гистохимическими методами -
непростая задача. Необходимо учитывать самые разнообразные факторы [43],
однако при должной осмотрительности гистохимические методы могут служить
эффективным инструментом для изучения дифференциальной экспрессии генов в
отдельных клетках и различных типах клеток, входящих в состав ткани.
Условия фиксации различны в зависимости от типа ткани и ее
проницаемости для фиксатора. Например, глутаровый альдегид с трудом
проникает в кутикулу листа, но очень быстро - в поперечные срезы стебля.
По-видимому, если после фиксации 2,5%-ным глутаральде-гидом в 0,1 М
NaP04 (pH 7,0) в течение 2-3 мин на льду предусмотрено тщательное
отмывание, то в ткани остается достаточное количество GUS. Способ
фиксации следует эмпирически подбирать для каждой новой системы.
Формальдегид может оказаться более мягким фиксатором, чем глутаральдегид,
и в нем можно проводить фиксацию дольше.
Наилучшим субстратом для гистохимического выявления [}-глюкуронидазы в
тканях и клетках служит 5-бро>м-4-хлор-3-индолилглюкуронид (X-GLUC). При
реакции с данным субстратом в области локализации фермента образуется
голубой осадок, но, к сожалению, этот субстрат довольно дорог. На
точность определения GUS влияют многие факторы, и для их нейтрализации
необходимо хорошо понимать ход реакции. Соединение, образующееся при
взаимодействии глюкуронидазы с X-GLUC, не окрашено. Для образования
нерастворимого и ярко окрашенного в голубой цвет конечного продукта
индоксильное производное, образующееся в ходе реакции, должно
подвергнуться окислительной димеризации. Такая димеризация стимулируется
атмосферным кислородом и может быть в значительной мере усилена при
использовании катализатора окисления, например, смесью феррицианида и
ферроцианида калия [43]. Результаты часто оказываются очень хорошими и
без применения данного катализатора/однако необходимо иметь в виду, что
пе-
Анализ организации и экспрессии генов растений
375
роксидазные примеси могут усилить видимую активность глюку-ронидазы.
Вероятность появления окрашивания в местах, где фермент отсутствует,
очень мала, однако относительная интенсивность окрашивания не обязательно
отражает различия в концентрации р-глюкуро'нидазы.
Другой способ гистохимического определения GUS основан на
использовании нафтол-АБВЬглюкуронида, при расщеплении которого образуется
свободный нафтол-ASBI. Последний затем связывается с диазокрасителем.
Ниже описан метод, успешно используемый для выявления GUS на срезах
трансгенных растений табака; срезы получали вручную.
6.9.7.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Опасная бритва.
- Эксикатор и источник вакуума.
- Предметные и покровные стекла.
- Микроскоп.
Растворы
- 0,5 М MES, pH 5,6. На 100 мл: растворяют 9,76 г MES (Sigma, по кат. №
М-8250) в 80 мл дистиллированной НгО. Доводят pH до 5,6 NaOH и доливают
до 100 мл. Хранят при комнатной температуре..
- Раствор для фиксации и (0,3%-ный формальдегид; 10 мМ MES, pH 5,6; 0,3
М маннитол). На 100 мл:
Формальдегид (40%-ный раствор; BDH) 750,0 мкл
0,5 М MES 2,0 мл
Маннитол 5,46 г.
Хранят при комнатной температуре под тягой в течение 3 мин либо до
появления осадка.
- 50 мМ \таР04, pH 7,0 (разд. 6.Э.5.2).
- Гистохимический реактив [2 мМ 5-бром-4-хлор-3-индолил-глюкуронид (X-
GLUC) в 50 мМ NaP04,pH 7,0]. На 10 мл: растворяют 10 мг X-GLUC (Research
Organics) в 300 мкл диметилформамида в пробирке из пирекса. Доводят до 10
мл 50 мМ NaP04, pH 7,0.*Каждый раз готовят свежий раствор. Сухой X-GLUC
хранят в эксикаторе при -20 или -70°С.
- 7%-ный этанол.
6.9.7.3. Методика
1. Приготавливают вручную бритвой тонкие срезы нефиксированных стеблей и
черешков листьев растений,, выращенных in vitro. Некоторые детали
приготовления срезов растителы-
376
Глава 6
ного материала для гистохимического исследования приведены в
