Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
Чашки Петри с сусло-агаром или агаром Чапека инокулируют исследуемыми
микроорганизмами уколом микологического крючка. Через 24-48 ч инкубации в
термостате при 26° С эти же чашки заливают вторым слоем агаризированной
питательной среды (1-3 мм) следующего состава (г/л): 5,0 KN03; 0,3
КН2Р04; 0,3 MgS04 ¦ 7Н20; 5,0 пептона;
10,0 глюкозы; 1 мл микроэлементов; 15,0 агар-агара; pH 6,5, содержащей
взвесь клеток хлореллы (смыв с одного косяка 3-5-дневной культуры,
выращенной на той же среде, в 500 мл питательной среды) и ставят в све-
тотеплицу с температурой 26° С. Через 4-5 сут инкубации вокруг
микроорганизмов - продуцентов фитотоксических веществ - образуются ясно
выраженные зоны отсутствия роста хлореллы.
XII.1.8. БИОПРОБА НА РЯСКЕ
(LEMNA MINOR L.) [312]
В чашки Петри, содержащие по 10 мл испытуемых растворов, вносят по 0,2 г
ряски, предварительно обсушенной фильтровальной бумагой, и оставляют на
ночь при комнатной температуре. На следующий день исследуемые жидкости
осторожно сливают, ряску дважды промывают 10 мл стерильной воды и
культивируют в течение недели в светотепли-це с 10-часовым световым днем
при 26° С в 20 мл органо-минеральной среды Хогланда следующего состава
(мг/л): 61,0 KN03; 95,0 Ca(N03)2 X X 4Н20; 49,0 MgS04 • 7Н20; 12,0
NH4H2P04; 0,5 железа виннокислого; 1000 сахарозы; 0,1 мл микроэлементов.
Затем биомассу отфильтровывают, обсушивают фильтровальной бумагой и
взвешивают. Часть ряски после взвешивания используют для определения
содержания хлорофилла.
XII.1.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕПЕНИ ТОКСИЧНОСТИ
КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ [297]
Степень токсичности сильно фитотоксичных штаммов определяют следующим
образом. Готовят серию разведений культуральной жидкости так, чтобы
каждое последующее разведение было в 2 раза больше предыдущего. Для
разведения пригодна водопроводная вода. Находят наименьшее разведение,
при котором еще обнаруживается фитотоксическое действие культуральной
жидкости. Активность культуральной жидкости определяют числом единиц,
равным наименьшему разведению, при котором еще проявляется
фитотоксическое действие.
XII.1.10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ДЕЙСТВИЯ
ФИТОТОКСИНОВ
Разные виды растений обладают неодинаковой чувствительностью к
фитотоксинам. Для выявления специфического и селективного действия этих
веществ используют набор растений - представителей разных семейств. Для
выявления селективного действия фитотоксинов на однодольные и двудольные
растения в качестве тестов лучше всего использовать семена пшеницы и
огурцов. При изучении фитотоксической актив-
324
ности культур микроскопических грибов целесообразно использовать
несколько биотестов, основанных на разных ростовых реакциях. Это
позволяет выявить органотропное и специфическое действие фитотоксинов на
процессы роста.
XII.2. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ФИТОТОКСИНОВ НА РАСТИТЕЛЬНУЮ КЛЕТКУ
ХИ.2.1. ДЕЙСТВИЕ ФИТОТОКСИНОВ НА ПРОТОПЛАЗМУ
Методы основаны на характерных свойствах живой протоплазмы, таких, как
способность к движению и адсорбции разных соединений, в частности
красящих веществ. В мертвой клетке движение протоплазмы прекращается, и
красящие вещества (пигменты), которые находятся в вакуолях, легко
диффундируют из протоплазмы в воду.
XII.2.1.1. ДЕЙСТВИЕ ФИТОТОКСИНОВ НА ДВИЖЕНИЕ ПРОТОПЛАЗМЫ
Листья элодеи (Elodea canadensis) просушивают на фильтровальной бумаге,
помещают в опытный раствор на вогнутом предметном стекле и исследуют
микроскопически. Отмечают время, через которое прекращается движение
протоплазмы.
XII.2.1.2. ДЕЙСТВИЕ ФИТОТОКСИНОВ НА ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКУЮ
МЕМБРАНУ КЛЕТКИ И СТЕНКИ ВАКУОЛЕЙ
Из свежей свеклы (Beta vuigaris f. rubra) пробочным сверлом вырезают
столбики диаметром 14-20 мм и разрезают их на диски толщиной 3-4 мм и
массой 0,5 г. Диски отмывают в проточной воде до прекращения выделения
антоциана с поверхности поврежденных клеток. Помещают диски в испытуемые
растворы и оставляют в холодильнике на 24 ч. Выход антоциана определяют с
помощью ФЭКа.
XII.2.2. ДЕЙСТВИЕ ФИТОТОКСИНОВ НА МИТОТИЧЕСКУЮ
АКТИВНОСТЬ МЕРИСТЕМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ
Размножение клеток является основой роста и морфогенеза растений.
Действие фитотоксинов на митоз определяют по митотической активности
меристематических тканей.
Трехдневные проростки гороха (или другого растения) помещают в раствор
токсина и выдерживают в термостате 48 ч при 26-27° С. Затем концы
корешков (5-7 мм) фиксируют смесью Карнуа (3 части этилового спирта и 1
часть уксусной кислоты) и окрашивают ацетокармином (2%-ный раствор
кармина растворяют при кипячении в 45%-ной уксусной кислоте).
Митотическую активность меристематических тканей изучают на давленных
препаратах. В 10 полях зрения микроскопа отмечают количество делящихся
клеток из 100 и рассчитывают митотический индекс по формуле: количество
делящихся клеток/1000 X X 100%.
325
XII.2.3. ДЕЙСТВИЕ ФИТОТОКСИНОВ НА РАСТЯЖЕНИЕ КЛЕТОК
Действие фитотоксинов на растяжение клеток лучше всего изучать в зоне
растяжения растущей части корня. Проростки кукурузы (или другого
