Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
полученным из растений, не подвергавшихся действию фитотоксина. Через
сутки измеряют прирост корней проростков и результаты выражают в
процентах ингибирования роста. По угнетению роста корней проростков судят
о наличии фитотоксина в отдельных органах растений [297].
Если фитотоксические вещества обладают антибиотической активностью,
целесообразно в качестве биотестов применять чувствительные к ним
культуры микроорганизмов. В этом случае из полученной кашицы делают
комочки и раскладывают их в чашки Петри на газон чувствительного к
фитотоксину тест-организма. После инкубации в термостате измеряют размер
зоцы подавления роста тест-организма и по их величине судят о накоплении
фитотоксина в разных органах растений. Для более точного определения
локализации фитотоксина растения целиком вынимают из раствора, промывают
водой, обсушивают фильтровальной бумагой и раскладывают в рамки на
двухслойный агар с тест-организмом. Рамки закрывают стеклом и помещают в
термостат. Места накопления токсина обнаруживают по образованию зон
отсутствия роста тест-микроорганизма.
XII.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУЗАРИЕВОЙ КИСЛОТЫ У ГРИБОВ
ХП.5.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Токсические вещества, образуемые рядом фитопатогенных грибов, нередко
являются одной из причин преждевременного увядания многих видов растений.
К числу таких соединений относится и фузариевая, или 5-я-
бутилпиколиновая, кислота [28, 29, 61, 69, 70, 523, 595, 596, 661, 643,
644, 648], которая образуется не только F. oxysporum, но и F.
moniliforme.
Поскольку фузариевая кислота ингибирует прорастание спор Ustil-lago zeae
(головни кукурузы) (до 50%), рост некоторых микроорганизмов, таких, как
Bacillus subtilis и Вас. mesentericus и некоторых других, эти бактерии
используют для определения фузариевой кислоты в культуральной жидкости,
329
XII.5.2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГРИЁОЁ
Изучаемые культуры грибов выращивают методом поверхностного (30-40 сут)
или погруженного культивирования (6 сут) на жидкой'среде Чапека. Состав
среды (г): 2 KN03; 1 КН2Р04; 0,5 MgS04 • 7 Н20; 0,5 КС1; 0,01 FeS04 • 7
Н20; 30 сахарозы; 1 л воды; pH 5,0 - 5,5.
По 10 мл питательной среды разливают в пробирки, засевают культурой
изучаемых грибов и выращивают методом поверхностного или погруженного
культивирования на пробирочных качалках при температуре 26° С [68].
XI 1.5.3. ВЫДЕЛЕНИЕ ФУЗАРИЕВОЙ КИСЛОТЫ
Культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрованием через бумажные
фильтры, подкисляют до pH 3,5 2 н. раствором соляной кислоты, добавляют
бутанол в соотношении 1 : 5. Смесь взбалтывают в делительной воронке в
течение 10 мин. После разделения слоев верхний бутанольный слой сливают в
испарительные чашки, а нижний не используют. Испарение проводят током
холодного воздуха в вытяжном
Схема выделения фузариевой кислоты
330
шкафу. Полученный осадок растворяют в 0,2 мл воды или спирта (схема).
Для получения фузариевой кислоты в кристаллическом виде доводят pH
культуральной жидкости 2 н. раствором соляной кислоты до
4,0 и тщательно взбалтывают с этилацетатом, взятом в соотношении 1 : 5.
Смесь отстаивают, в делительной воронке отделяют этилацетат и испаряют.
Полученный осадок растворяют в небольшом количестве воды, подщелачивают
бикарбонатом натрия до pH 8-8,5. Препарат очищают, встряхивая дважды с
половинным объемом эфира. Затем культуральную жидкость отделяют, снова
подкисляют до pH 4,0, добавляют пятикратный объем эфира и снова тщательно
взбалтывают. Эфир сливают в испарительные чашки. После испарения эфира
образуются кристаллы фузариевой кислоты розоватого цвета.
XII.5.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУЗАРИЕВОЙ КИСЛОТЫ
XII.5.4.1. МЕТОД БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Определение фузариевой кислоты проводят методом восходящей бумажной
хроматографии с последующим биоавтографическим проявлением на тест-
культуре Вас. subtilis.
0,1 мл растворенного осадка элюата наносят на полосы хроматографической
бумаги 23 X 1 см на расстоянии 1,5 см от нижнего края. Полоски помещают в
пробирки высотой 20 см, диаметром 2 см, содержащие 5 мл смеси
растворителей бутанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении
4:1:5. После разгонки полоски хроматографической бумаги просушивают в
токе холодного воздуха и просматривают в УФ-лучах (Rf фузариевой кислоты
0,87-0,88, с темно-серым или красно-коричневым свечением). Затем
приступают к биоавтогра-фическому проявлению хроматограмм.
Наличие фузариевой кислоты определяют на газоне суточной культуры Вас.
subtilis по образованию стерильных зон вокруг хроматограмм, помещенных на
бактериальный газон. Среди фузариев встречаются штаммы, культуральная
жидкость которых при хроматографии образует пятна, имеющие в УФ-лучах
различные оттенки голубого цвета. Rf таких пятен колеблется от 0,50 до
0,55. При биоавтографическом проявлении хроматограмм отмечено совпадение
зон угнетения роста Вас. subtilis с расположением пятен с Rf 0,50-0,55.
Изучаемые культуры фузариев могут образовывать три типа зон угнетения
тест-культуры. Первый тип характеризуется зоной угнетения роста Вас.
