Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
растения) помещают на 1 ч в раствор токсина. Затем опытные и контрольные
проростки выращивают на фильтровальной бумаге, увлажненной водой, в
кюветах в термостате при температуре 26-27° С. Через определенные
промежутки времени измеряют длину корней линейкой с точностью ± 1 мм и
длину растягивающихся клеток (на продольных срезах жиеых корней,
сделанных от руки с помощью окулярной линейки под микроскопом (лучше
всего на МБИ-11) при увеличении в 100 раз).
ХН.З. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ФИТОТОКСИНОВ НА РАСТЕНИЯ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ
ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ [81, 413]
Культура изолированных органов и тканей представляет весьма удобную живую
модель для сравнительного изучения многих процессов роста и метаболизма
растительного организма, в котором эти процессы протекают в условиях
сложных взаимоотношений и коррелятивных связей. Использование
изолированных тканей и органов растений в качестве биотестов для изучения
действия фитотоксических веществ имеет преимущество перед другими
методами вследствие быстроты и удобства проведения опытов в строго
контролируемых условиях.
XII.3.1. КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ
В изолированной культуре обычно выращивают прокамбиальные ткани стебля,
ткани, содержащие первичный и вторичный камбий, сосудистую паренхиму
корнеплодов и клубней и др.
Прокамбиальную ткань стебля готовят следующим образом. Сегменты мясистого
стебля растений (табак, подсолнечник, томаты и др.), изолированные в зоне
второго и третьего междоузлий, моют, стерилизуют и часть первичной коры
удаляют скальпелем. Затем кусочки ткани длиной 2-2,5 см или диски
толщиной 2-3 мм переносят на питательную среду, соблюдая условия
физиологической полярности, т. е. помещая отрезок стебля апикальным
концом в питательную среду.
Для получения тканей мясистых корней и клубней отбирают здоровые,
непораженные вредителями корнеплоды и клубни, чистят их, тщательно моют и
помещают между листами стерильной бумаги. Затем в продольном направлении
извлекают из них длинные столбики (с помощью пробочного сверла) диаметром
3-5 мм, которые разрезают на диски толщиной 1,5-2,0 мм. Для опытов берут
ткань обычно из верхней трети корнеплода. Аналогичным образом готовят
листовую ткань, которую культивируют с целью изучения закономерностей
роста и метаболизма части пластинки молодого листа.
Для стерильных органов и тканей растений, из которых изолируется ткань
для культуры, существует набор различных стерилизующих веществ. Наиболее
распространенными являются растворы, содержащие активный хлор:
гипохлориты кальция и натрия, хлорная известь, хлор-
326
амины. Растворы готовят следующим образом: определенное количество
вещества перед употреблением взбалтывают в 1 л воды в течение 10 мин,
затем отфильтровывают и используют для стерилизации растительного
материала.
Для культивирования изолированных тканей предложено много питательных
сред. Большинство нормальных тканей выращивают обычно на среде Хеллера, в
состав которой входят (мг/л): 750 KCI; 600NaN03; 250 MgS04 • 7Н20; 125
NaH2P04 . Н20; 75 СаС12 . Н20; 20 ООО сахарозы и 1 мг/л раствора
микроэлементов. Раствор микроэлементов по Хеллеру состоит из (мг/л): 1
FeCl3 • 6 Н20; 1 ZnS04 • 7Н20; 1 Н3В03; 0,1 MgS04 • 4Н20; 0,03 CuS04 •
5Н20; 0,03 А1С13; 0,03 NiCl2 . 6Н20; 0,01 KJ. Среду стерилизуют при
давлении 1 атм в течение 10-15 мин. К питательной среде перед
автоклавированием добавляют раствор фитотоксина. В контроле вместо
раствора фитотоксина добавляют такое же количество воды.
Изолированные ткани выращивают на поверхности полутвердой агаровой
питательной среды или в жидкой среде. В первом случае сегменты стебля и
большие кусочки тканей корнеплода или клубни погружают в агар на г/3 их
длины, маленькие диски и кубики тканей помещают на поверхность среды. При
этом способе выращивания ткань, находясь в воздухе, хорошо аэрируется,
что очень важно для роста культуры. Культивирование ткани в жидкой
питательной среде имеет ряд преимуществ перед первым способом (ткань
лучше снабжается питательными веществами, легче происходит удаление
токсических веществ и т. п.), но требует аэрации.
Культуру тканей выращивают в темноте при температуре 26-27° С. Аэрация
обеспечивается выращиванием на качалках, роллерах или (в жидкой среде)
барботажем воздухом. В конце опыта определяют сырую массу культуры и, в
зависимости от целей опыта, различные физиологические и биохимические
показатели. Характеристикой роста является прирост ткани за определенный
отрезок времени (%): W = = [(Wt - 1F0)/1F0] • 100, где Wt - конечная, W0
- начальная масса культуры.
XII.3.2. КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ КОРНЕЙ
Стерильные семена растений (люцерны, гороха, пшеницы, кукурузы и др.)
проращивают в стерильных условиях в чашках Петри на водном агаре в
темноте при температуре 25-27° С. После прорастания семян от проростков
отрезают стерильными ножницами кончики корней длиной 2-3 см и переносят в
колбы с питательной средой. Для получения надежных и четких результатов в
