Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
100 г адсорбента, очищенного 100 мл гексана. Затем через колонку
пропускают 900 мл гексана, который отбрасывают. Токсин F-2 элюируют из
колонки смесью гексана и диэтилового эфира (2 : 1 по объему), собирая
фракции объемом 60 мл (30 фракций).
Полученное вещество имеет температуру плавления 164° С и
хроматографически однородно. В тонком слое силикагеля на пластинках си-
луфол в системе толуол - этилацетат - 85%-ная муравьиная кислота Rf
полученного токсина равно 0,53. При нанесении 50 мкг вещества на
пластинки получают только одно пятно, которое при облучении УФ-светом
флюоресцирует голубовато-зеленоватым цветом, а при обработке серной
кислотой и прокаливании приобретает коричневый оттенок. Чувствительность
определения токсина посредством ТСХ и выявления под УФ-светом с
максимумом 360 нм приближается к 0,02- 0,05 мкг. Выделенный микотоксин
соответствует зеараленону (F-2-лактон-6-10-окси-6-оксотранс-1-ундеценил-
резорциновой кислоты).
Х.З.6.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАГОКСИНОВ
Пораженный субстрат экстрагируют смесью хлороформ - метанол (95 : 5) в
аппарате Сокслета, затем водным раствором бикарбоната натрия, отделяют
водный слой и подкисляют его. Хроматографируют в тонком слое силикагеля и
проявляют в растворе бензол - уксусная кислота (3 : 1). Пятна охратоксина
А в УФ-лучах имеют зеленое свечение, Rf составляет 0,5, охратоксины В и С
флюоресцируют голубовато-зеленым цветом и имеют соответственно Rf 0,35 и
0,65.
Пораженный субстрат экстрагируют метанолом, насыщенным водой, и "-
гексаном, затем разделяют на целитовой колонке. Хроматографируют на
тонком слое силикагеля. Интенсивность свечения пятен определяют по
сравнению со стандартом. Чувствительность метода-25 мкг токсина в 1 кг
субстрата.
Х.3.7. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Спектрофотометрический метод анализа широко применяют для установления
связи между спектрами поглощения различных веществ и их химическим
строением и составом. Для количественного определения различных веществ
используют или непосредственное поглощение света раствором определяемого
вещества или определяемый компонент переводят с помощью химических
реакций в соединения, имеющие характерный спектр поглощения. Для
получения спектра поглощения, т. е. кривой светопоглощения, построенной в
координатах D =f (к) или е = / (Я), проводят серию измерений оптической
плотности растворов или молярного коэффициента светопоглощения при разных
длинах волн в интересующей области спектра. Измерения проводят через 10-
20 нм, а найдя границу максимума, промеряют эту область через
814
I-2 нм. По полученным данным строят кривую. В соответствии с природой
светопоглощения и возможностями оптических приборов поглощение света
измеряют в видимой (400-700 нм), ультрафиолетовой (185-400 нм) и
инфракрасной (760-1 мм) областях спектра. Кривые светопоглощения обычно
снимают с помощью спектрофотометров [31, 77, 313].
Спектрофотометры типа СФ-4 позволяют работать не только с окрашенными
растворами, которые поглощают свет в видимой области спектра, но и с
"бесцветными" для глаза растворами, которые поглощают свет в УФ или
ближайшей ИК областях спектра: СФ-4, СФ-4а, СФД-2 - 760 - 1100 нм; СФ-8,
СФ-9 - 760 - 2500 нм. Спектрофотометрический метод применяется наряду с
элементным анализом для идентификации микотоксинов (см. раздел XIII,4.),
XI. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АЛКАЛОИДОВ
Микроорганизмы являются признанными продуцентами алкалоидов - производных
индола. В последние годы обнаружено, что в культурах бактерий,
актиномицетов, микроскопических грибов накапливаются вещества,
относящиеся по ряду признаков к алкалоидам 22, 585].
XI.1. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Предварительные опыты по отбору продуцентов рекомендуется проводить на
средах следующего состава (г):
1. 50,0 маннита; 5,4 янтарной кислоты; 0,3 MgS04 • 7Н20;
1,0 К2НР04; до 1 л водопроводной воды; раствор подщелачивают NH4OH до
pH 5,2; соли вносят после подщелачивания.
2. 20,0 глюкозы; 2,0 кукурузного экстракта; 2,0 пептона; 2,0 К2НР04; 0,2
дрожжевого экстракта (порошок); 2,0 MgS04 * 7Н20; до 1 л дистиллированной
воды.
Погруженное культивирование проводят в колбах объемом 750 мл, содержащих
150 мл среды, на качалках при 200-260 об/мин. Для поверхностного
культивирования используют матрацы емкостью 1,5 л с 200 мл среды, в
состав которой входит маннит (среда 1). Использовать вертикальные качалки
с гнездами для пробирок, применяемые для отбора продуцентов антибиотиков,
не рекомендуется из-за небольшого объема анализируемого материала и
низкой чувствительности некоторых методов идентификации алкалоидов, а
также в связи с тем, что при продолжительном выращивании происходит
значительное уменьшение объема среды вследствие испарения.
Температура термостатной комнаты 24 ± 1°С. Погруженное культивирование
при посеве с исходной среды рекомендуется производить не более 20,
поверхностное - не более 60 сут. При дальнейшей работе с конкретным
продуцентом сроки культивирования, особенно при погруженном методе,
