Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
ячей 0,8 мм, экстрагируют 20 мин на качалке смесью 80 мл ацетонитрила и
20 мл 4%-ного раствора КС1, фильтруют через двойной бумажный фильтр и 100
мл фильтрата переносят в делительную воронку объемом 250 мл.
Очистка экстракта. В делительной воронке экстракт дважды обезжиривают
изооктаном (по 50 мл). Ацетонитрильный слой упаривают в роторном
испарителе при 40-45° С. Остаток перерастворяют в 20 мл ацетонитрила. Для
лучшей очистки экстракта загрязняющие примеси осаждают уксуснокислым
свинцом. С этой целью к экстракту, растворенному в ацетонитриле,
добавляют 60 мл воды и 20 мл 20%-ного уксусного свинца, энергично
встряхивают смесь и оставляют на 1-2 мин для образования осадка, после
чего добавляют 5 г целита 545. Экстракт перемешивают и фильтруют. 50 мл
фильтрата переносят в делительную воронку и трижды промывают хлороформом
(50; 20 и 20 мл). Хлороформ объединяют и упаривают, сухой остаток
растворяют в 200 мкл смеси бензол - ацетонитрил (98 : 2 по объему)
(экстракт А). В случае высоких концентраций микотоксинов экстракт А
разбавляют еще в 5 раз (экстракт Б), В качестве основной системы для
определения
охратоксина А, зеараленона, стеригматоцистина, пеницилловой кислоты и
цитринина используют систему ТЭМ-толуол - этилацетат- муравьиная кислота
(6:3:1 по объему). Поскольку в этой системе не всегда удается добиться
разделения афлатоксинов В2 и Gx, при определении последних применяют
систему БМУ - бензол - метанол - уксусная кислота (24 : 2 : 1 по объему).
В случае присутствия в экстракте одного охратоксина А дополнительной
системой может служить хлороформ- этанол (95 : 5 по объему), в которой
афлатоксины имеют большие значения Rf, чем охратоксины, и последние идут
в области, относительно свободной от загрязнений.
Для разделения цитринина и охратоксина А при их одновременном присутствии
можно рекомендовать следующие системы: диэтило-вый эфир-метанол-вода-
муравьиная кислота (95 : 4 : 1 : 1) и ацетон- хлороформ - вода (12 : 88 :
1,5). При определении патулина методом двухмерной хроматографии применяют
пластинки "Силуфол UV-254".
Условия хроматографирования. На хроматографическую бумагу наносят
микрошприцем на 10 мкл 2; 4; 6; 8 и 10 мкл исходного раствора А, а также
шесть пятен со стандартными растворами микотоксинов (г о 5 мкл каждого) и
разгоняют в системах указанных выше растворителей. Хроматограммы
просматривают под источником УФ-лучей с длиной волны 365 нм (МИГ-1) и
выбирают пятно экстракта, по величине и интенсивности флюоресценции
визуально совпадающее со стандартом токсина. На основании полученных
данных вычисляют содержание микотоксина (мкг/кг) : М = 200 • 4 • 1000
д/50 V, где п - содержание микотоксина в пятне стандарта (мкг); V - объем
пятна экстракта Л, равного по флюоресценции стандарту (мкл); 50 - навеска
зерна (г); 200 - конечный объем экстракта (мкл); 4 - коэффициент,
учитывающий использованный объем экстракта; 1000- для пересчета
содержания токсинов на 1 кг зерна. При использовании экстракта Б в
числитель вводят коэффициент 5.
X.3.6.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПОКСИТРИХОТЕЦЕНА Т-2 [151]
Токсические вещества экстрагируют в течение суток, расходуя 150 мл
ацетона на 50 г субстрата. Водную фазу, полученную после удаления
ацетона, разбавляют в 2 раза водой, и токсин экстрагируют смесью гексана
и диэтилового эфира (1 : 1; 2 раза по 1 л). Остаток после выпаривания
экстракта смешивают с 40 мл смеси хлороформа и гексана (Г. 1). По 20 мл
смеси вносят в колонку с 30 г активированного силикагеля АСК (40-60 меш).
Каждую колонку промывают 200 мл гексана. Затем пропускают смесь
хлороформа и гексана, собирая в фарфоровые чашки фракции по 250 мл,
которые выпаривают. 2-4 фракции объединяют по максимальному содержанию
компонента при газохроматографическом анализе с электронно-захватным
детектором, а остаток вносят в колонку с 15 г активированного силикагеля
КСК (150-200 меш). Токсин элюируют смесью гексана и диэтилового эфира,
собирая фракции по 20 мл (40 фракций). Кристаллы белоснежного вещества,
выделившегося в пробирках из 10-30 фракций после удаления эфира,
объединяют. Продукт перекристаллизовывают из смеси гексана и эфира,
высушивают над безводным хлористым кальцием и подвергают анализу
различными физико-химическими методами. Сравнение ИК-и масс-спектров
полученного вещества со спектрами уже известных трихотеценов позволяет
установить его принадлежность к микотоксину Т-2, который был выделен из
Fusarium tricinctum, Fusarium spo-rotrichiella var. tricinctum.
313
Х.3.6.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗЕАРАЛЕНОНА [232]
Микотоксин экстрагируют из субстрата ацетоном. Маслянистый коричневый
остаток в чашке реэкстрагируют в 1 л диэтилового эфира, который
обезвоживают, пропуская через слой (3 см) безводного сульфата натрия, и
выпаривают досуха. Полученное после выпаривания эфира масло растворяют в
20 мл эфира и смешивают с 20 г силикагеля АСК. Эфир удаляют под струей
воздуха, а силикагель с маслом вносят в верхнюю часть колонки, содержащей
